Kromatin düzenlenmesi ve transkripsiyonel regülasyonda rol alan histon asetiltransferaz komplekslerinin alt birimleri arasındaki etkileşimlerin karakterizasyonu - Çalışkan, Gizem (My University, 2019)
Amaç: Gen ekspresyonunun transkripsiyonel regülasyonunda anahtar role sahip STAGA protein kompleksinin katalitik alt birimlerinin protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: Tez kapsamında belirlenmesi amaçlanan protein-protein etkileşimleri ilk olarak maya 2 hibrit teknoloji kullanılarak in vivo analizlenmiştir. Çalışılan proteinler insan proteinleri olduğu için maya 2 hibrit yöntemi ile maya hücrelerinde belirlenen etkileşimlerin doğrulanması amacıyla insan hücre hatlarında spesifik antikorlar varlığında eş-immün çöktürme analizleri yapılmıştır. Fiziksel olarak etkileşimleri test edilen proteinlerin aynı hücre kompartmanında bulunduklarının incelenmesi için floresan mikroskop altında eş-lokalizasyonları görüntülenmiştir.Bulgular ve Sonuçlar: Tez kapsamında STAGA kompleksi histon asetiltransferaz modülü alt birim proteini ADA3’ün etkileşim partner proteinleri; AATF, PHF21A, PPP2R5D ve PPP1R7’nin modülün enzimatik aktivitesinden sorumlu GCN5 ile etkileşimleri ve etkileşimlerden sorumlu gen bölgeleri maya 2 hibrit yöntemi ile belirlenmiştir. Memeli hücrelerinde ADA3 partner proteinlerinin kompleksin deubikütinaz enzimatik aktivitesine sahip diğer modülünün alt birimleri USP22, ATAXIN7L3 ve ENY2 ile etkileştikleri gözlenmiş ve floresan mikroskopi ile eş-lokalizasyonları görüntülenmiştir. STAGA’nın kompleks içindeki etkileşimlerinin spinoserebellar ataksi 7 hastalığındaki rollerini anlamak için ADA3’ün ATAXIN7’nin yabanıl tip ve mutant formu ile etkileşimleri maya 2 hibrit yöntemi ile analizlenmiş ve belirlenen etkileşimler memeli hücrelerinde incelenerek doğrulanmıştır.

Aim: It is aimed to determine the protein-protein interactions of the catalytic subunits of STAGA protein complex, which has a key role in the transcriptional regulation of gene expression.Material Methods: The protein-protein interactions to be determined in the context of the thesis were first in vivo analyzed using yeast two hybrid technology. Since the proteins studied are human proteins, co-immuneprecipitation analyses were performed in the presence of specific antibodies using human cell lines to confirm the interactions determined in yeast cells by the yeast two hybrid method. Co-localizations were visualized under the fluorescence microscope to analyze the physically interacting proteins that were tested in the same cell compartment.Results and Conclusion: The interaction partner proteins of STAGA complex histone acetyltransferase module subunit protein ADA3 which are AATF, PHF21A, PPP2R5D and PPP1R7 with GCN5 responsible for the enzymatic activity of the module and gene regions responsible for interactions were determined by yeast two hybrid method within the scope of the thesis. ADA3 partner proteins were observed to interact with subunits USP22, ATAXIN7L3 and ENY2 of the other module of the complex with deubiquinase enzymatic activity, and their co-localization were monitorized by fluorescence microscopy in mammalian cells. To understand the role of the internal interactions of the STAGA in spinocerebellar ataxia 7 disease, the interactions of ADA3 with the wild-type and mutant form of ATAXIN7 were analyzed by yeast-two hybrid method and the determined interactions were verified in mammalian cells.
Keywords: Biotechnology; Biyoteknoloji; co-immunoprecipitation; eş-immün çöktürme; histon asetil transferazlar; histone acetyl transferases; maya 2 hibrit; protein-protein etkileşimleri; protein-protein interactions; Transcriptional regulation; Transkripsiyonel regülasyon; yeast two hybrid