İnfluenza A virüsü NS1 proteini ile ilişkilendirilen konak hücre proteinlerinin viral replikasyona etkileri - Pirinçal, Ayşegül (My University, 2021)
Amaç: İnfluenza A virüsleri Orthomyxoviridae ailesi içerisinde yer alan RNA virüsleridir. Bu çalışmada influenza A virüsleri ile enfekte hücrelerde viral NS1 proteini ile EEF1G, LSG1 veya DDX56 proteinleri arasındaki ilişkinin aydınlatılması ve bu ilişkinin virüs replikasyonu açısından öneminin ortaya konması amaçlanmıştır. Gereç ve yöntem: İnfluenza A virüsü NS1 proteini ile konak proteinleri arasındaki etkileşimin saptanmasında maya ikili-hibrit metodu, immün çöktürme, GST ile çöktürme ve immünfloresans tekniklerinden yararlanıldı. Etkileşim modellerinin analizleri in siliko yöntemler kullanılarak yapıldı. Geçici transfeksiyon ile EEF1G, LSG1 veya DDX56 protein miktarları arttırılan; ya da siRNA veya CRISPR/ Cas9 teknikleri ile ilgili genleri susturulan hücreler influenza A/ WSN/ 1933-H1N1 (WSN) veya A/ Duck/ Pennsylvania/ 1984-H5N2 (DkPen) virüs tipleri ile enfekte edildi ve bu hücrelerde viral replikasyonun seyri izlendi.Bulgular: Maya ve memeli hücreleri ile yapılan testler NS1 proteininin EEF1G, LSG1 ve DDX56 proteinleri ile etkileşim gösterdiğini ortaya koydu. HEK293 hücrelerinde EEF1G miktarındaki artışın her iki virüs tipinin replikasyonunu; LSG1’deki artışın sadece DkPen tipi virüs replikasyonunu yavaşlattığı saptandı. Buna karşın DDX56’daki artış virüs replikasyonu üzerinde anlamlı bir değişime neden olmadı. Bununla birlikte, siRNA’lar ile DDX56 geni susturulan hücrelerde WSN tipi virüs replikasyonunun negatif yönde etkilendiği görüldü. CRISPR/ Cas9 tekniği ile EEF1G geni mutasyona uğratılan hücrelerde DkPen tipi virüslerin; LSG1 geni mutasyona uğratılan hücrelerde her iki virüs tipinin replikasyonunda yavaşlama saptandı. Sonuç: Bu çalışmada in vivo, in vitro ve in siliko analizler sonucunda insan EEF1G, LSG1 ve DDX56 proteinlerinin NS1 proteini ile ilişkili olduğu ortaya kondu. Bu proteinlerden EEF1G proteininin influenza A virüsleri üzerinde negatif yönde, LSG1 ve DDX56 proteinlerinin ise pozitif yönde etkiye sahip olduğu saptandı.

Objective: Influenza A viruses are RNA viruses belonging to the Orthomyxoviridae family. In this study, it was aimed to elucidate the relationship between the viral NS1 protein and EEF1G, LSG1 or DDX56 proteins in influenza A virus infected cells, and to reveal the importance of this relationship in terms of virus replication.Materials and methods: Yeast two-hybrid assay, co-immunoprecipitation, GST pull-down and immunofluorescence techniques were used to determine the interaction between influenza A virus NS1 and host proteins. The interaction models were analyzed by using in silico methods. EEF1G, LSG1, or DDX56 proteins were over-expressed in the cells by transiently transfection. The cells were knockdown or knockout with siRNA or CRISPR/ Cas9 techniques, respectively. These cells were infected with influenza A/ WSN/ 1933-H1N1 (WSN) or A/ Duck/ Pennsylvania/ 1984-H5N2 (DkPen) viruses and the viral replication was examined.Results: The studies with yeast and mammalian cells revealed that the NS1 protein interacts with EEF1G, LSG1, and DDX56 proteins. The over-expression of LSG1 in HEK293 cells only caused the slowdown of the DkPen type virus replication, while EEF1G slowed down the replication of both virus types. In contrast, the overexpression of DDX56 did not cause a significant change in the replication of viruses. However, it was observed that the WSN type virus replication was negatively affected in the knock down cells for DDX56. It was shown that only influenza A DkPen type viruses replication was a slowdown in the cells mutated for EEF1G gene with the CRISPR/ Cas9 technique, whereas, both of influenza A WSN and DkPen virus replication were slowdown in the cells mutated for LSG1 gene.Conclusion: In this study, the results of in vivo, in vitro and in silico analyzes revealed that human EEF1G, LSG1, and DDX56 proteins have interaction with the NS1 protein. Among these proteins, EEF1G protein was found to have a negative effect on influenza A viruses, whereas LSG1 and DDX56 proteins were found to have a positive effect.
Keywords: Biochemistry; Biyokimya; DDX56; DDX56 Influenza A virus; EEF1G; İnfluenza A virüsü; LSG1; NS1 protein; NS1 proteini