İnsan MTCH2 proteininin influenza A virüsü replikasyonuna etkilerinin moleküler düzeyde araştırılması - Ulupınar, Pınar (My University, 2022)
İnfluenza A virüsleri Orthomyxoviridae ailesi içerisinde sınıflandırılan, membranlı virüslerdir. İnsanlarda daha çok mevsimsel grip etkeni olan bu virüslerin pandemilere neden olma potansiyeli yüksektir. İnfluenza A virüslerinin replikasyonu ve transkripsiyonu virus genomunun ilk üç segmenti üzerinden kodlanan PB1, PB2 ve PA proteinlerinin oluşturduğu viral RNA polimeraz enzimi tarafından gerçekleştirilir. Çeşitli hücresel proteinler ile de ilişkili olan bu proteinler, viral patogenez açısından da büyük önem taşırlar. Bu tez çalışmasında da maya ikili hibrit metodu kullanılarak PA proteini ile ilişkisi belirlenen insan MTCH2 proteininin influenza virüsü replikasyonuna etkilerinin moleküler düzeyde belirlenmesi amaçlandı. Çalışmada hücre hattı olarak insan orijinli HEK293 ve HeLa hücrelerinden yararlanıldı. Viral replikasyonun izlenmesinde influenza A/ WSN/ 1933/ H1N1 ve A/ Duck/ Pennsylvania/ 1984/ H5N2 virüs tipleri kullanıldı. HEK293 ve/ veya HeLa hücrelerinde MTCH2 protein düzeyi, bu proteini kodlayan plazmit DNA ile transfeksiyon, özgün siRNA’lar ile transfeksiyon veya CRISPR/ Cas9 tekniği ile knockout etme yöntemleri ile değiştirildi. Viral replikasyonun seyri, virüs proteinlerinin Western melezleme ile belirlenmesi ve minireplikon testleri ile izlendi. Maya hücrelerinde İnfluenza A virüsü PA proteini ile etkileşim gösteren insan MTCH2 proteinin, insan orijinli HeLa ve HEK293 hücrelerinde de etkileşim gösterdiği ve virüsü replikasyonu etkileyen önemli bir hücresel faktör olduğu ortaya kondu. HeLa hücrelerinde birlikte sentez edilen PA ve MTCH2 proteinlerinin benzer lokalizasyon profilleri göstermesi bu iki proteinin fiziksel etkileşimini destekler nitelikte bulundu.

Influenza A viruses are membrane-bound viruses classified in the Orthomyxoviridae family. These viruses, which are mostly seasonal flu agents in humans, have a high potential to cause pandemics. Replication and transcription of influenza A viruses are carried out by the viral RNA polymerase enzyme formed by PB1, PB2 and PA proteins encoded on the first three segments of the virus genome. These proteins, which are also associated with various cellular proteins, are also of great importance in terms of viral pathogenesis. In this thesis, it was aimed to determine the effects of human MTCH2 protein on influenza virus replication at the molecular level, whose relationship with the PA protein was determined by using the yeast two hybrid method. In this study, HEK293 and HeLa cells of human origin were used as cell lines. Influenza A/ WSN/ 1933/ H1N1 and A/ Duck/ Pennsylvania/ 1984/ H5N2 virus types were used to monitor viral replication. The MTCH2 protein level in HEK293 and/ or HeLa cells was altered by transfection with plasmid DNA which is encoding the protein, transfection with specific siRNAs, or knockout with the CRISPR/ Cas9 technique. The course of viral replication was monitored by Western hybridization of virus proteins and minireplicon tests. : It was revealed that human MTCH2 protein, which interacts with the influenza A virus PA protein in yeast cells, also interacts in HeLa and HEK293 cells of human origin and is an important cellular factor affecting virus replication. Similar localization profiles of PA and MTCH2 proteins co-expressed in HeLa cells were found to support the physical interaction of these two proteins.
Keywords: Biochemistry; Biyokimya; CRISPR/ Cas; İnfluenza A; MTCH2; PA protein; PA proteini İnfluenza A; viral RNA polimerase; viral RNA polimeraz