Rekombinant bakulovirüsler tarafından kodlanan SARS-CoV-2 spike proteinlerinin böcek hücrelerinde üretilmesi ve hücre içi protein trafiğinin izlenmesi - Simsar, Merve (My University, 2025)
Tüm dünyayı etkisi altına alan SARS-CoV-2 virüsünün en önemli yüzey antijen proteini olan ve aşı olarak kullanım potansiyeline sahip spike proteininin uygun bir formda ve yeterli miktarlarda üretilebilmesi büyük önem taşımaktadır. Bu çalışmada spike proteininin Sf9 ve Hi5 böcek hücrelerinde bakulovirüs ekspresyon sistemi ile heterolog olarak üretilmesi, hücre içi trafiğinin izlenmesi ve bu proteinin optimum üretim koşullarının saptanması amaçlanmıştır. Rekombinant bakulovirüsler ile enfekte edilen Sf9 ve Hi5 hücrelerinde spike proteini sentezi ve proteinin zaman içinde ortama salgılanması SDS-PAGE/ gümüş boyama ve/ veya Western melezleme yöntemleriyle analiz edilmiştir. Hücrelerdeki spike proteinlerin sentezi ve hücre içindeki yerleşimi immünfloresan teknikler kullanılarak incelenmiştir. Enfekte hücre hatları ile yapılan SDS-PAGE/ gümüş boyama tekniği ile protein analizi, spike protein seviyelerinin enfekte olmuş hücrelerde, diğer hücresel proteinlerden çok daha yüksek olduğunu göstermiştir. Enfekte hücre kültürlerinde rekombinant spike proteinlerinin sentezinin 48 ve 72. saatte önemli ölçüde arttığı görülmüştür. IF sonuçlarında ekspresyonun enfeksiyonun 64. saatinde neredeyse tüm hücrelerde gerçekleştiği gözlemlenmiştir. Western melezleme analizleri, enfekte hücre kültürlerinde besiyerine salgılanan, rekombinant spike proteinlerinden daha düşük molekül ağırlığa sahip kırpılmış spike proteinlerinin varlığını ortaya koymuştur. Bu çalışma, rekombinant bakülovirüsler üzerinden kodlanan spike proteinin enfekte böcek hücrelerinde etkin bir şekilde sentezlendiği ortaya koymuştur. Deney sonuçları rekombinant spike proteinin glikozilasyon ve proteolitik kesim gibi translasyon sonrası modifikasyonlara uğradığını göstermiştir. Bakülovirüs ekspresyon sisteminin COVID-19'a karşı etkili alt birim aşısının ana bileşeni olarak spike proteininin üretimi için uygun düşük maliyetli bir sistem olduğu sonucuna varılmıştır.

The production of the spike protein, which is the most important surface antigen of the SARS-CoV-2 virus affecting the whole world and has potential for use in vaccines, in an suitable form and sufficient quantities is of great importance. In this work, the heterogues production of the spike protein in Sf9 and Hi5 insect cells using the baculovirus expression system, the monitoring of its intracellular trafficking, and the identification of the optimal production conditions for these proteins are aimed. The synthesis of the spike protein and its secretion into the medium over time in Sf9 and Hi5 cells infected with recombinant baculoviruses were analyzed using SDS-PAGE/ silver staining and/ or SDS/ Western blotting techniques. The synthesis and intracellular localization of the spike protein in the cells were examined using immunofluorescence techniques. Protein analysis with SDS-PAGE/ silver staining of infected cell lines showed that the spike protein levels were significantly higher in the infected cells compared to other cellular proteins. The synthesis of recombinant spike proteins in infected cell cultures was found to increase significantly at the 48 and 72 hour time points. Immunofluorescence results revealed that its expression occurred in nearly all cells at the 64 hour time point of infection. Western blot analysis showed the presence of truncated spike proteins with lower molecular weight than the recombinant spike proteins, which were secreted into the culture medium of infected cells. This study demonstrated that the spike protein was effectively synthesized in insect cells infected with recombinant baculoviruses. The results showed that the recombinant spike proteins underwent post-translational modifications such as glycosylation and proteolytic cleavage. It was concluded that the baculovirus expression system is a suitable and low-cost system for the production of the spike protein.
Production of SARS-CoV-2 spike proteins with recombinant baculoviruses and monitoring of intracellular protein trafficing in insect cells
Keywords: Baculovirus; Bakulovirüs; Böcek; Farmasötik biyoteknoloji; Hücresi; Insect cells; Pharmaceutical biotechnology; Recombinant protein; Rekombinant protein; SARS; SARS CoV-2; SARS-CoV-2; Spike protein; Spike proteini; Viruses; Virüsler