Hücre farklılaşması ve olgunlaşmasında etkili sinyal ileti yolları - Öz Arslan, Devrim (My University, 2004)
Bu çalışmada K562 hücrelerinin farklılaşması, monosit/ makrofaj farklılaşması ve dendritik hücrelerin olgunlaşmasını düzenleyen sinyal ileti yollarının incelenmesi planlandı. K562 hücrelerinden toplam RNA elde edilerek Gas ve Ga16 mRNA'ları RT-PCR tekniği ile çoğaltıldı. Heminle eritroid farklılaşmaya indüklenen farklılaşmış ve farklılaşmamış K562 hücrelerinde Ga16 mRNA ekspresyonun olmadığı, Gas mRNA ekspresyonun ise farklılaşmayla değişmediği gözlendi. K562 hücrelerinin eritroid farklılaşması sırasında ERK fosforilasyonun önemli ölçüde değişmediği Western emdirimi analizi ile belirlendi. Sağlıklı vericilerin monositlerinden, in vitro koşullarda olgunlaşmamış ve olgun dendritik hücreler (iDH ve mDH) oluşturuldu. Hücreler daha sonra çeşitli GPCR ligandları ile muamele edilerek ERK1/ 2 fosforilasyonu Western emdirimi analizi ile izlendi. Bu ligandların tümü iDH'lerde ERK1/ 2 fosforilasyonuna yol açarken, mDH'lerinde yalnızca MIP-3b, ERK1/ 2 fosforilasyonuna neden olduğu görüldü. DH'lerin boğmaca toksini (PTX) ile muamele edilmesi sonucunda, Gi/ o kadar Gq proteinlerinin de DH'lerdeki ERK1/ 2 fosforilasyonuna katkısı olduğu saptandı. Aynı zamanda DH'lerdeki LPA ve S1P reseptörleri flow sitometrik analizle incelendiğinde, DH'lerin; S1P1, S1P3, S1P5 ve LPA2 reseptörlerini ekspres ederken, S1P2, S1P4 , LPA1 ve LPA3 reseptörlerini ekspres etmedikleri bulundu. Western emdirimi analizi ile de S1P1, S1P3, S1P5, LPA2 reseptör ekspresyonu saptandı ve S1P4 reseptörünün ise iDH'lerde daha fazla olmak üzere DH'lerde bulunduğu görüldü. Fura-2 ile işaretlenmiş monosit ve makrofajlarda LPA ve S1P uyarısı sonrasında hücre içi [Ca+2]i mobilizasyonu incelendiğinde, LPA'in ve S1P'ın insan monosit ve makrofajlarında [Ca+2]i mobilizasyonuna yol açtığı saptandı. Bizim bulgularımız, daha önceki bulgularla uyumlu olarak G proteinlerin hücre farklılaşmasını, hücre tipine ve uyarana bağlı olarak farklı biçimde etkileyebildiğini işaret etmektedir. iDH'lerin ve mDH'lerin çeşitli GPCR ligandlarına yanıtta farklı sinyal ileti yollarını kullandıkları gözlendi ve DH'lerde LPA ve S1P reseptörlerinin varlığı protein düzeyinde ilk defa bu çalışmada gösterilmiştir.

TEZ BAŞLIK Signal Transduction Pathways Involved in Cell Differentiation and Maturation SUMMARY This study was designed to investigate the role of signal transduction pathways that modulate erythrocytic differentiation of K562 cells, differentiation of monocytes/ macrophages and maturation of dendritic cells. Total RNA was isolated from K562 cells and amplified for Gas and Ga16 mRNAs by RT-PCR. Ga16 mRNA expression was not observed in K562 cells. K562 cells were found to express Gas mRNA; however, the level of expression did not change upon differentiation induced by hemin. The extent of phosphorylation of ERK demonstrated by Western blot analysis did not change remarkably upon erythroid differentiation of K562 cells. Immature and mature dendritic cells (iDCs and mDCs) were generated in vitro from monocytes of healthy donors. Cells were then treated with various GPCR agonists and the state of phosphorylation of ERK1/ 2 was determined using Western blot analysis. All the ligands phosphorylated ERK1/ 2 in iDCs, however, only MIP-3ß phosphorylated ERK1/ 2 in mDCs. Pertussis toxin (PTX) treatment of DCs suggested that Gi/ o as well as Gq proteins are involved in phosphorylation of ERK1/ 2 in DCs. We also examined the LPA and S1P receptors in DCs using flow cytometry and found that DCs express S1P1, S1P3, S1P5, LPA2, but not S1P2, S1P4 , LPA1 and LPA3 receptors. Western blot analysis verified the results for S1P1, S1P3, S1P5, LPA2 but contradicted those for S1P4 receptors, which were found to be expressed predominantly on iDCs. We studied calcium [Ca+2]i mobilization in fura-2-labelled monocytes and macrophages in response to LPA and S1P. LPA and S1P induced the mobilization of [Ca+2]i in human monocytes and macrophages. Our data agree with previous reports which show that G proteins are able to influence cell differentiation in different ways, depending on the cell type and stimulus. We have observed that iDCs and mDCs use different signalling pathways in response to various GPCR agonists. This is the first study that demonstrates the presence of LPA and S1P receptors on DCs at the protein level.
Keywords: Biyofizik; Hücreler