Purification and characterization of lipase produced by cryptococcus strains isolated from petroleum sludge : assessment of its applicatıon in industry - Büyük, Esra (My University, 2020)
Bu çalışmada, petrol çamurundan izole edilen maya suşları olan Cryptococcus albidus D24 ve Cryptococcus diffluens D44'ten lipazın saflaştırılması ve karakterizasyonu incelenmiştir. D24 ve D44'ten lipazın saflaştırma çalışmalarında ilk olarak amonyum sülfat ve aseton çöktürmesi birincil adım olarak uygulanmıştır. C. albidus D24'ten lipaz, her iki çöktürme yöntemine de etkili bir yanıt vermemiştir. Bu sonuçlar: %90 amonyum sülfatta %2.24 geri kazanım ve 0.44 saflaştırma katı verirken, aseton ile çöktürmede %0.64 geri kazanımla 0.01 saflaştırma katı vermiştir. Diğer yandan, C. diffluens D44'ten elde edilen lipaz, en yüksek saflaştırma katını aseton çöktürme sonunda 1.12 saflaştırma katı ve %84 ile enzim geri kazanımını verirken, amonyum sülfat ile verimli bir şekilde çöktürülememiştir. Sonuç olarak, saflaştırma adımına C. diffluens D44'ten elde edilen lipaz ile devam edilmiştir. Enzim çöktürüldükten sonra D44 lipazı, DEAE sefaroz anyon değişimi ile saflaştırılmış ve iki farklı pik (Lip1 ve Lip4) elde edilmiştir. Lip1 ve Lip4' ün Sephadex G-100 jel filtrasyonuna yüklenmesi sonucunda 3 farklı pik elde edilmiştir. Bunların saflaştırma katsayıları ve verimleri karşılaştırıldığında Lip1-1 %2.4 geri kazanımla ve 1.0 saflaştırma katsayısıyla, Lip1-2, %7.2 geri kazanımla ve 0.8 saflaştırma katıyla ve Lip4-1, 1.2 saflaştırma katı ve %4.5 verimle sonuçlanmıştır. Bu kısmen saflaştırılmış lipazların moleküler ağırlıkları, farklı bant aralıklarında SDS-PAGE jeli üzerinde gözlemlenmiştir.Saflaştırma işleminin ardından karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Lip1-1, Lip1-2 ve Lip4-1 için optimum sıcaklıklar sırasıyla 60ºC, 65ºC ve 65ºC olarak bulunmuştur. Lip1-1 ve Lip1-2 için optimum pH değeri 9.0 iken, pH 5.0 Lip4-1 için optimum olarak bulunmuştur. Termo stabilite analizi 50ºC, 60ºC ve 70ºC'de yapılmıştır ve sonuçlar lipaz enzim aktivitesinin 250. dakikadan sonra 50ºC 'de azalmaya başladığını ve bu üç tip lipazın 70ºC' de ise 30. dakikadan itibaren aktivitelerinin düştüğü belirlenmiştir. %10 metanol, bu lipazların rölatif aktivitesini arttırırken, bunun tersine, %10 etanol, Lip1-2 dışındaki lipazların rölatif aktivitesini düşürmüştür.Ek olarak, C. albidus D24 ve C. diffluens D44'ün saflaştırılmamış lipazından şeker esterlerinin sentezi incelenmiştir.

In this thesis, purification and characterization of lipase from Cryptococcus albidus D24 and Cryptococcus diffluens D44, which are the yeast strains isolated from petroleum sludge, were investigated. In the purification studies of lipase from D24 and D44, firstly ammonium sulfate and acetone precipitation were applied as a primary step. Lipase from C. albidus D24 did not response to both precipitation methods giving 0.44 purification fold with 2.24% recovery at 90% ammonium sulfate and 0.01 purification fold with 0.64% recovery at acetone precipitation. On the other hand, lipase from C. diffluens D44 gave the highest purification fold and enzyme recovery as 1.12 and 84%, respectively at the end of acetone precipitation whereas it was not efficiently precipitated by ammonium sulfate. As a result, the purification step was continued with lipase from C. diffluens D44. After enzyme precipitation, D44 lipase was purified by DEAE sepharose anion exchange and it resulted in two different peaks (Lip1 and Lip4). Further purification of Lip1 and Lip4 by Sephadex G-100 gel filtration resulted in three types of lipases as Lip1-1 at 1.0 purification fold with 2.4% recovery, Lip1-2 at 0.8 purification fold with 7.2% recovery and Lip4-1 at 1.2 purification fold with 4.5% recovery and molecular weights of these partially purified lipases were observed on SDS-PAGE gel at different bands ranges. Characterization of these three lipases was carried out and optimum temperatures were found as 60ºC, 65ºC and 65ºC for Lip1-1, Lip1-2 and Lip4-1 respectively. Optimum pH of Lip1-1 and Lip1-2 were determined as pH 9.0 while Lip 4-1 showed highest activity at pH 5.0. Thermo stability analysis was performed at 50ºC, 60ºC and 70ºC and results showed that lipase enzyme activity decreased after 250 minutes at 50ºC and decreased at 70ºC after 30 minutes for these three types of lipases. 10% methanol enhanced the relative activity of these lipases on the contrary 10% ethanol reduced the relative activity of lipases except Lip1-2. Additionally, the synthesis of sugar esters from crude lipase of C. albidus D24 and C. diffluens D44 was evaluated.
Keywords: Bioengineering; Biyomühendislik; enzim lipase; enzyme; lipaz