Endotel hücrelerinde 17 Beta-Estradiol’un akut etki mekanizmasının araştırılması - Onaran, Nurperi Hızal (My University, 2003)
Deneysel ve klinik çalışmalar estrojenin damar yapısı ve fonsiyonları üzerinde olumlu etkileri olduğunu göstermektedir. Estrojenlerin gen transkripsiyonunu modüle ederek uzun sürede etki gösterdikleri bilinmesine karşın, son yıllardaki çalışmalar E2' nin hızlı ve nongenomik etkileri de olduğunu ortaya çıkarmıştır. Estrojenin bu etkilerini membranda varlığı henüz kanıtlanmamış estrojen reseptörü aracılığı ile hücre içi sinyal ileti yolaklarının aktivasyonu vasıtasıyla gerçekleştirdiği ileri sürülmekle beraber bu etki mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Bu çalışmada, endotel hücrelerde estrojenin hızlı sinyal ileti mekanizmasına ışık tutmak amacıyla, 17 b-estradiol' ün (E2) tirozin kinaz yolu aktivasyonu üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Akut E2' nin tirozin fosforilasyonu üzerindeki etkisi, insan göbek kordon ven endotel hücre (HUVEC) kültürlerinin E2, genistein veya tamoksifen ile inkübasyonundan sonra elde edilen hücre lizatlarında immünblotting yöntemi ile araştırıldı. İlaveten E2' nin fosfolipaz C gama (PLC g)' nın tirozin fosforilasyonu üzerindeki etkisi, hücre lizatının anti-fosfotirozin antikor ile immunpresipite edilmesinden sonra anti- PLC g antikoru kullanılarak incelendi. E2' nin MAPK aktivitesi üzerindeki etkisi ise anti-aktif MAPK antikoru kullanılarak tespit edildi. Bulgularımızda 5 dakika 100 nM E2 ile inkübe edilmiş endotel hücre kültürlerinde, genomik etki ile bağdaşmayan bir hızda ~120 ve 65 kDa'luk proteinlerin tirozin fosforilasyonunun arttığı bu etkinin tirozin kinaz inhibitörü genistein veya estrojen reseptör antagonisti tamoksifen ile azaldığı görülmektedir. Bulgularımız aynı zamanda estrojenin PLC g' nın tirozin fosforilasyonunu artırmadığını göstermektedir. MAPK (ERK1,2) aktivitesi üzerindeki çalışmalarda ise E2 ve EGF'nin MAPK fosforilasyonunu artırdığı genistein ve tamoksifen bu artışı bloke ettiği saptanmıştır. Sonuçlarımızdan E2 ile akut olarak uyarılmış endotelde tirozin fosforilasyonu artan proteinlerin sinyal ileti yoluna ait proteinler olabileceği söylenebilir. Bununla birlikte PLC g' nın aktivasyonunun E2' nin akut sinyal ileti yolunda rolü olmadığı görülmektedir. HUVEC' te E2' nin akut etkisi ile tirozin fosforilasyonu artan bu proteinlerin saflaştırılması ve karakterizasyonu endotel hücrelerde estrojenin akut etkisinde aktive olan sinyal ileti yolunun açıklanmasına ışık tutabilir. INVESTIGATION OF THE MECHANISMS OF THE ACUTE EFFECT OF 17b-ESTRADIOL ON ENDOTHELIAL CELLS

Many experimental and clinical studies have demonstrated significant effects of estrogens on vascular structure and function. Estrogens are known to show long term effects by modifying the transcription of certain genes. However there is accumulating evidence that estrogens also have rapid and nongenomic effects which are mediated by putative membrane receptors that are coupled to cytosolic signal transduction proteins. The mechanism of rapid signalling is not completely clear and the aim of this study is to investigate the mechanism of rapid signalling of E2 on endothelial cells. In this study, confluent human umbilical vein endothelial cells were incubated with 17b-Estradiol (E2), genistein or tamoxifen and the cells were lysed. Tyrosine phosphorylated proteins in lysed cells were detected with monoclonal anti-phosphotyrosine antibody by immunoblotting. In addition the role of E2 on tyrosine phosphorylation of phospholipase C gamma (PLC g) was investigated by immunoblotting with anti-phospholipase C gama antibody after immunoprecipitation with anti-phosphotyrosine antibody. Effect of E2 on MAPK activity was investigated by immunoblotting with anti-activated MAPK antibody. Immunoblotting with anti-phosphotyrosine antibody demonstated that 5 min incubation with 100nM E2 increases the tyrosine phosphorylation proteins of around 120 kDa and 65 kDa Mr. In the presence of the tyrosine kinase inhibitor genistein and the estrogen receptor antagonist tamoxifen the level of tyrosine phosphorylation under these conditions was reduced by 71% and 59% respectively. Our data also demonstrates that E2 treatment does not increase the phosphorylation of phospholipase C-g. Western blot analysis demonstrates that E2 and EGF increases MAP kinase (ERK1, 2) activity while genistein and tamoxifen blocks the activation of MAPK. It can be concluded that the proteins whose tyrosine phosphorylation was increased may be involved in the signal transduction pathway stimulated by E2 in HUVEC. Our results also demonstrated that PLC g activation is not involved in this pathway. Purification and characterization of these proteins may help to shed light on the E2 induced signalling pathway in endothelial cells.
Keywords: Biyokimya