Babesia bigemina laktat dehidrogenaz enziminin moleküler karakterizasyonu ve enzimin hesaplamalı yapısal biyoloji yaklaşımıyla incelenmesi - Bostancıoğlu, Safiye Merve (My University, 2025)
Babesia bigemina, kene vektörleri aracılığıyla sığır eritrositlerine yerleşerek gelişen anaerob obligat ve tek hücreli bir apikompleksan parazittir. “Teksas ateşi” olarak bilinen hastalığa neden olmaktadır. Günümüzde tedavi amaçlı birçok anti-babesiyal ilaçlar kullanılmaktadır. Ancak bu ilaçlara karşı direnç oluşturan bazı parazitlerin görüldüğü ve ilaçların kullanıldığı hayvanlarda ilaç kalıntılarının et ve süt ürünlerinde kalabildiği raporlanmıştır. Bu nedenle yeni hedeflerin araştırılması ve bu hedeflere özgü inhibitörlerin belirlenmesi önem arz etmektedir. Uygun hedeflerden biri de anaerobik glikolizin düzenlenmesinde kritik rol oynayan laktat dehidrogenaz (LDH) enzimidir. Apikompleksan LDH’leri genellikle aktif bölgede beş amino asitlik bir insersiyon sergilemektedir ve bu özellikleri, onları konağın LDH'sinden ayırmaktadır. Bu yapısal farklılık, apikompleksan LDH'yi terapötik müdahale için potansiyel olarak seçici bir ilaç hedefi haline getirmektedir. Tez çalışmasında bu yüzden ilaç hedefi olarak B. bigemina laktat dehidrogenaz (BbigLDH) enzimi belirlenmiştir. Çalışma iki kısımdan oluşmaktadır. Birinci kısımda gerçekleştirilen in silico çalışmalar sonucunda, konak LDH’si ile düşük afinite gösteren ancak BbigLDH’si ile yüksek afinite gösteren bileşikler belirlenmiştir. Ardından GROMACS (100 ns) ve Desmond (20 ns) ile moleküler dinamik simülasyon (MDS) analizleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca daha uzun MDS sürelerinde (300 ns ve 1000 ns) bağlanmalarını koruyabilen bileşikler belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci kısmında ise, öncelikle E. coli BL21 (DE3)’e BbigLDH geni içeren plazmid vektörün transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Elde edilen rekombinant E. coli aracılığıyla His-etiketli BbigLDH proteini ekspresyonu ve saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Daha sonra enzim aktivite ve kinetik analizleri yapılmıştır. Gerçekleştirilen in silico çalışmaların sonucunda BbigLDH’nin de beş amino asitlik insersiyona sahip olduğunu, karşıt döngüde (opposing loop) Plasmodium aksine antik LDH yapısındaki gibi delesyonun olmadığını, bu durumların ilaç çalışmalarında dikkate alınması gerektiği vurgulanmıştır. Ayrıca yapılan yanaştırma ve MDS analizleri sonucunda C9 (Z2373310039), C16 (Z2201943136), C18 (Z2063989764) bileşiklerinin BbigLDH için uygun inhibitör adaylarının olabileceği anlaşılmıştır. Öte yandan in vitro çalışmalarda ise, enzimin optimum ekspresyon koşullarının belirlemesi için yapılan analiz sonucunda, 37oC’de 1 mM IPTG ile bir gece (ON) indüklemenin en uygun koşullar olduğu belirlenmiştir. Enzim HisTALON afinite kromotografisi ile yüksek oranda saflaştırılmıştır. Kinetik analizleri sonucunda yarı-maksimum hızda görülen görünür substrat konsantrasyonu (S0.5) için NADH 0.3094 mM olarak belirlenip, pirüvat için Michaelis-Menten sabiti (Km) ise 0.2585 mM olarak bulunmuştur. Maksimum hızlar (Vmax), sırasıyla NADH için 59.2 U mg-1 protein min-1 ve pirüvat için 23.97 U mg-1 protein min-1 olarak ölçülmüştür. Ayrıca stabilite testleri sonucunda en iyi şartın +4 oC’de katkısız olarak 9. güne kadar saklanması uygun görülmüştür. Enzim 30oC ve 40oC’lerde aktivitesini koruyabilirken daha yüksek sıcaklılarda koruyamamaktadır. Optimum pH değeri ise 8.5 olarak bulunmuştur. Çalışma hedefli ilaç üretimi için temel bir çalışma olup BbigLDH enzimini inhibe edebilecek potansiyel adayların belirlenmesine temel sağlamaktadır. Bu çalışmanın, günümüzde bilinen anti-babesiyal ilaçlara ek olarak alternatif ilaçların geliştirilmesinde öncülük edebileceği ve yalnızca parazite etki eden ancak konağa zarar vermeyen hedefli ilaçların üretilmesine aracılık edebileceği ön görülmektedir. Bu gibi çalışmaların yapılması diğer apikompleksan türü parazitlere yönelik hedefli ilaç geliştirilmesinde önemli bir örnek teşkil etmesi beklenmektedir.

Babesia bigemina is an anaerobic obligate and unicellular apicomplexan parasite that develops by settling in the erythrocytes of cattle through tick vectors. It causes the disease known as Texas fever. Today, many anti-babesial drugs are used for treatment. However, it has been reported that some parasites resistant to these drugs have been observed and that drug residues may remain in meat and dairy products of treated animals. Therefore, investigating new targets and identifying inhibitors specific to these targets is of great importance. One suitable target is the enzyme lactate dehydrogenase (LDH), which plays a critical role in the regulation of anaerobic glycolysis. Apicomplexan LDHs typically exhibit a five-amino-acid insertion in the active site, which distinguishes them from the host LDH. This structural difference makes apicomplexan LDH a potentially selective drug target for therapeutic intervention. In this thesis study, the B. bigemina lactate dehydrogenase (BbigLDH) enzyme was identified as a drug target. The study consists of two parts. In the first part, in silico studies were conducted to identify compounds that show low affinity for the host LDH but high affinity for BbigLDH. Subsequently, molecular dynamics simulation (MDS) analyses were performed using GROMACS (100 ns) and Desmond (20 ns). Additionally, compounds that maintained their binding over longer MDS durations (300 ns and 1000 ns) were identified. In the second part of the study, the transformation of a plasmid vector containing the BbigLDH gene into E. coli BL21 (DE3) was performed. Using the obtained recombinant E. coli, the expression and purification of His-tagged BbigLDH protein were carried out. Then, enzyme activity and kinetic analyses were performed. As a result of the in silico studies, it was determined that BbigLDH possesses the fiveamino-acid insertion and, unlike Plasmodium, does not exhibit a deletion in the opposing loop, similar to the ancient LDH structure. These factors should be considered in drug development studies. Moreover, docking and MDS analyses revealed that compounds C9 (Z2373310039), C16 (Z2201943136), and C18 (Z2063989764) could be suitable inhibitor candidates for BbigLDH. In vitro studies determined that the optimal expression conditions for the enzyme were induction with 1 mM IPTG overnight (ON) at 37°C. The enzyme was highly purified using HisTALON affinity chromatography. Kinetic analyses showed that the apparent substrate concentration (S0.5) at half-maximal velocity for NADH was 0.3094 mM, and the Michaelis-Menten constant (Km) for pyruvate was found to be 0.2585 mM. The maximum velocities (Vmax) were measured as 59.2 U mg⁻¹ protein min⁻¹ for NADH and 23.97 U mg⁻¹ protein min⁻¹ for pyruvate. Additionally, stability tests indicated that the best storage condition was at +4°C without additives for up to 9 days. The enzyme retained activity at 30°C and 40°C but could not maintain stability at higher temperatures. The optimum pH was determined to be 8.5. This study serves as a fundamental work for targeted drug production, providing a basis for identifying potential candidates that can inhibit the BbigLDH enzyme. It is anticipated that this study could lead to the development of alternative drugs in addition to currently known anti-babesial drugs and facilitate the production of targeted drugs that specifically affect the parasite without harming the host. Conducting such studies is expected to set an important precedent for the development of targeted drugs against other apicomplexan parasites.
Molecular characterization of babesia bigemina lactate dehydrogenase enzyme and investigation of the enzyme by computational structural biology approach
Keywords: Babesia bigemina; babesiosis; Biology; Biyoloji; computational structural biology; hesaplamalı yapısal biyoloji; Lactate dehydrogenase; Laktat dehidrogenaz; structure-based drug discovery; yapı-temelli ilaç keşfi