Construction of Amylolytic Nuclear Petite Saccharomyces Cerevisiae Strains For Bioethanol Production By SSF - Arslan, Doğa (My University, 2008)
BİYOETANOL ÜRETİMİ İÇİN AMİLOLİTİK SOLUNUM EKSİKLİĞİ OLAN SACCHAROMYCES CEREVISIAE SUJLARININ GELİŞTİRİLMESİ Etanol önemli bir enerji kaynağı olarak kabul edilir ve son birkaç yılda, dünyada ki artan enerji krizi ile beraber biyoetanol üretimi giderek daha da önem kazanmıştır. Biyoethanol üretiminde, yüksek enerji gerektiren pişirme prosesini takiben nişastanın fermente olabilen şekerlere hidrolizi, amilaz gibi amilolitik enzimler tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu prosesin yüksek üretim maliyetine sahip olması, yeni ve yenilikçi teknolojilerin geliştirilmesini kaçınılmaz kılmıştır. Bu sebeple, düşük ekonomik fizibiliteye sahip geleneksel çok aşamalı proseslere alternatif olarak, nişastanın, amilolitik mayalar kullanarak eş zamanlı hidroliz ve direkt fermentasyonunu sağlayan proseslerin geliştirilmesi önem kazanmıştır. Yüksek enerji gerektirmeyen, yeni fermentasyon sistemleri için, biyoetanol üretimini önemli ölçüde arttıracak, amilolitik solunum eksikliği olan Saccharomyces cerevisiae sujları geliştirilmiştir. Ancak bu sujların endüstriyel kullanımı için, amilolitik enzimleri kodlayan genlerin kopya sayısının ve kararlılığının arttırılması gerekliliği anlaşılmıştır. Bu sebeple, üç ana aşama içeren bir klonlama stratejisi geliştirilmiştir. Bu aşamalar, DNA kasedinin oluşturulması, bu kasedin S. cerevisiae genomic ribosomal DNA (rDNA) bölgesine entegre edilmesi, ve son olarak, farklı fermentasyon stratejileri kullanılarak etanol üretiminin artırılması olarak özetlenebilir. Bu çalışmanın amacı, bu geliştirilmiş stratejide ki, ilk ve en önemli basamak olan DNA kasedini rekombinant DNA teknolojisi kullanarak oluşturmaktır. Bu doğrultuda, yapılmış olan çalışmalar sonucunda, LEU2 seçici bölgesi ile amilolitik enzimleri içeren gen bölgesinin 25S rRNA genine klonlanması ile elde edilmiş olan rekombinant plazmidden, PCR amplifikasyonu ile DNA kasedi başarılı bir şekilde elde edilmiştir.

CONSTRUCTION OF AMYLOLYTIC NUCLEAR PETITE SACCHAROMYCES CEREVISIAE STRAINS FOR BIOETHANOL PRODUCTION BY SSF Ethanol has been regarded as an important energy source and production of bioethanol has become more essential in the world’s energy crisis in last few decades. The energy intensive high temperature cooking process followed by hydrolysis of starch to fermentable sugars by amylolytic enzymes such as amylases in the current bioethanol production process warrants novel and innovative new technology for reducing the total manufacturing cost. The use of amylolytic yeasts for the direct fermentation of starch in a simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process is an alternative to the conventional multistage process which offers poor economic feasibility. For the development of a novel noncooking fermentation system, a respiratory-deficient nuclear petite amylolytic Saccharomyces cerevisiae strain was constructed that improved the bioethanol yields significantly. For the industrial use of this strain, high-copy and stable expression of amylolytic activity was required and hence a cloning strategy has been developed that involved three major steps, namely, construction of a DNA cassette, multiple integration of the cassette into the ribosomal DNA (rDNA) locus of S. cerevisiae genome and finally improving the ethanol productivity of the amylolytic integrands by various fermentation strategies. Aim of this thesis was to focus on the first and the most crucial step of the strategy that involved the construction of the DNA cassette using tools of Recombinant DNA Technology. By cloning the genes for the amylolytic enzymes together with the LEU2 selective marker region into the gene for 25S rRNA, the DNA cassette was successfully obtained by selective PCR amplification of the region of interest from the constructed recombinant plasmid.
Keywords: Amilolitik Solunum Eksikliği; Biyoetanol; Biyoetanol Üretimi; Biyomühendislik