İnfluenza virüsü nuklear eksport proteini ile nukleoporin proteinleri arasındaki ilişkinin moleküler düzeyde araştırılması - Şenbaş, Burçak (My University, 2019)
Amaç: İnfluenza A virüsleri insanlarda tekrarlayan grip salgınlarına yol açan viral bir patojendir. Diğer RNA virüslerinin aksine bu virüslerin replikasyon ve transkripsiyonları konak hücre nukleusunda gerçekleşir. Dolayısıyla viral ribonukleoprotein partiküllerinin nukleo-sitoplazmik transportu gereklidir. Virüs replikasyonu için önemli olan bu olayda viral nuklear eksport proteini (NEP) olarak da bilinen NS2 proteini ve konak hücre nukleoporinleri işlev görmektedir. Transport olayının moleküler düzeyde mekanizması çok iyi bilinmemektedir. Bu çalışmada, nuklear transportta iş gören NUP214 ve NUPL2 proteinleri ile viral NS2 proteininin memeli hücrelerinde ilişkilerinin aydınlatılması amaçlandı.Gereç ve Yöntem: Farklı bir çalışma kapsamında maya ikili-hibrit metodu ile ilişkilendirilen NUP214 ve NUPL2 ile viral NS2 proteinleri arasındaki etkileşimi memeli hücrelerinde araştırmak için birlikte immün-lokalizsayon ve birlikte çöktürme testlerinden yararlanıldı. Bunun için insan NUP214 ve NUPL2 ile viral NS2 proteinlerini kodlayan plazmitler oluşturuldu. Bu plazmitler ile geçici olarak transfekte edilen HeLa hücrelerinde nuklear por kompleksi proteinleri ile influenza A virüsü NS2 proteinin hücre içi lokalizasyonları immünfloresan teknikler ile saptandı. Benzer şekilde plazmitler ile transfekte edilen HEK293 hücrelerinden hazırlanan lizatlarda spesifik antikorlar kullanılarak ya da glutatyon sefaroz ile söz konusu proteinler çöktürüldü ve çökelen proteinler SDS-PAGE / western melezleme tekniği ile analiz edildi. Bulgular ve Sonuç: İmmünfloresan testler, geçici olarak transfekte edilen HeLa hücrelerinde NS2 ve NUP214 proteinlerinin birlikte lokalize olduklarını saptadı. İmmün çöktürme ve glutatyon sefaroz ile çöktürme testlerinde de NS2 ve NUP214 proteinlerin birlikte çökeldiği görüldü. HEK214 hücrelerinde NUP214’ün aşırı ekpresyonunun influenza A virüsü replikasyonunu negatif yönde etkilediği saptandı. İnfluenza NS2 proteini ile NUPL2 arasında uygulanan koşullarda beklenen etkileşim saptanamadı.

Aim: Influenza A viruses are viral pathogens that cause recurrent epidemics in humans. Unlike other RNA viruses, replication and transcription of influenza occur in the cell nucleus. Therefore, nucleic-cytoplasmic transport of vRNPs are required. In this event, which is important for virus replication, NS2 protein (also known as NEP), ve nucleoporins are involved. The molecular mechanism of the transport is not known well. In this study, we aimed to elucidate the relationship between NUP214 and NUPL2 proteins and NS2 in mammalian cells.Material and Methods: To investigate the interaction between NUP214 and NUPL2 and viral NS2 proteins in mammalian cells, are relationship was shown with yeast two-hybrid method in a different project, co-immunolocalization and co-precipitation tests were carried out. For this, the plasmids encoding human NUP214 and NUPL2 and viral NS2 proteins were constructed. The localization of influenza NS2 ve nuclear por complex proteins in transiently transfected HeLa cells was detected by immunofluorescence technique. Similarly, the lysates were prepared form transiently transfected HEK293 cells and, the proteins precipitated using specific antibodies or with Glutathione Sepharose form lysates were analyzed by SDS-PAGE / western blotting technique.Results and Discussion: It was found that NS2 and NUP214 proteins were co-localized in HeLa cells, which were transiently transfected with immunofluorescence assay. The NS2 ve NUP214 proteins were co-recipitated with specific antibodies or with Glutathione Sepharose. The over- expression of NUP214 in HEK214 cells negatively affected the influenza A virus replication. The expected interaction between influenza NS2 protein and NUPL2 was not detected under applied conditions.
Keywords: Genetics, Biochemical; Genetik, Biyokimyasal; Influenza; İnfluenza Nucleoporin; NS2; Nukleoporin; NUP214; NUPL2