An exploratory study of the physiology of B. marmarensis and the optimization of PHB production - Atakav, Yağmur (My University, 2023)
Yeni bir aşırı zorunlu alkalifilik bakteri olan Alkalihalobacillus marmarensis, (eşanlamlısı: Bacillus marmarensis) Türkiye’nin Marmara Bölgesinden izole edilmiş olup, Alkalihalobacillus cinsine aittir. Ürettikleri hidrolitik enzimler, poli-(3-hidroksibütirat) (PHB) üretim yolakları ve kontaminasyona karşı dayanıklılığı, bu mikroorganizmayı biyorafinasyon ve biyoproses uygulamaları için uygun bir organizma haline getirmektedir. Bu doğrultuda bu tez çalışmasında, B. marmarensis’in farklı koşullardaki fizyolojik davranışı ve bu koşulların PHB, laktat ve proteaz üretimine etkisi incelenmiştir. Daha önce yürütülen araştırmalara dayanarak, ilk olarak, farklı konsantrasyonlarda K+ ve Mg+2 iyonlarının, karbon kaynağı olarak glikoz, laktoz ve zeytinyağının B. marmarensis’in fizyolojisine ve PHB sentezine etkisi incelenmiştir. Laktoz varlığında, PHB konsantrasyonu, glikoza kıyasla 2,5-3 kat artmış fakat çalışılan karbon kaynaklarının hiçbiri ticari üretim için umut vaat eden bir PHB konsantrasyonuyla sonuçlanmamıştır. Ardından, maya özütü, pepton ve et özütü gibi azot kaynakları varlığında, laktoz, zeytinyağı, ve glikoz gibi karbon kaynaklarının kullanımından sorunlu metabolik yolakları anlamak için, kullanılan karbon kaynakları ile anote edilen enzimler arasındaki ilişki değerlendirilmiştir. Daha sonrasında, hücre kütlesi (CDM) ile laktat ve proteaz gibi fermentasyon ürülerinin sentezi arasındaki etkileşimi anlamak amacı ile et özütü ve peptonun farklı konsantrasyonlarının CDM, laktat ve proteaz sentezi ürerine etkisi, Central Composite Design kullanılarak değerlendirilmiştir. Alkalifillerin ekstrem pH ortamlarında büyümesi genellikle düşük hücre kütlesiyle sonuçlandığından, bu koşulların araştırılması literatüre olan katkısı açısından büyük önem taşımaktadır. Deney sonuçlarına göre, en yüksek kuru hücre kütlesi, glikoz varlığında, %1,2 et özütü ve %3,8 peptonla elde edilmiştir. Maksimum laktat konsantrasyonu %2,275 et özütü ve % 1,325 peptonda ulaşılırken, en yüksek proteaz aktivitesine % 1,5 et özütü ve % 0,4 pepton varlığında ulaşılmıştır.CDM ile proteaz ve laktat sentezi arasındaki ilişki nedeniyle, sistemin davranışını tanımlamak ve tahmin yürütmek amacıyla Doğrusal, Kuadratik ve Purekuadratik modellerin uygunluğu da araştırılmıştır. Ayrıca, her bir değişken için optimum koşullar değiştiğinden, çok amaçlı optimizasyon ile CDM-Laktat Konsantrasyonu, CDM-Proteaz aktivitesi ve Laktat Konsantrasyonu-Proteaz aktivitesi arasındaki ilişki belirlenmeye çalışılmıştır. Bu tez çalışmasında, B. marmarensis’in alkalen proteaz üretim kapasitesi temel alınarak, B. marmarensis’den alkalen proteaz üretiminde, soya fasulyesi küspesi, buğday kepeği atığı, yonca samanı, ayçekirdeği atığı, mısır küspesi ve şeker pancarı atığı gibi çeşitli tarımsal-endüstriyel yan ürünlerinin kullanımı değerlendirilmiştir. İncelenen atık maddeler arasında, soya fasulyesi küspesi, ayçekirdeği atığı ve mısır küspesi ile alkali proteaz üretimi sağlanmıştır. Bildiğimiz literatür bilgilerine göre, bu çalışma, hem hücre kütlesiyle Alkalihalobacillus marmarensis’in fermentatif ürünleri arasındaki ilişkiyi hem de yeni tanımlanan bu bakterinin tarımsal-endüstriyel yan ürünler ile kullanım potansiyelini araştıran ilk çalışmadır.

A novel extreme obligate alkaliphilic Alkalihalobacillus marmarensis (synonym: Bacillus marmarensis), isolated from Marmara Region of Turkey, belongs to Alkalihalobacillus genus. Its hydrolytic enzymes, poly-(3-hydroxybutyrate) (PHB) production pathways, and contamination resistance, make it suitable for biorefining and bioprocesses applications. PHB, a biodegradable polymer, has garnered attention for its eco-friendly attributes. To this end, this thesis addresses the pivotal challenge of optimizing the production of PHB along with other value-added products such as lactate and proteases. Based on prior research, we first examined how B. marmarensis responds to different concentrations of K+ and Mg2+ ions, glucose, lactose, and olive oil to synthesize PHB. Although PHB titer was increased 2.5 - 3 times with lactose compared to glucose, interestingly, none of the carbon sources studied yielded a promising PHB amount for commercial production. Then, in order to understand the metabolic pathways responsible for the utilization of carbon sources as lactose, olive oil, glucose in the presence of nitrogen sources as yeast extract, peptone, and meat extract, the relationship between carbon sources used and annotated enzymes were evaluated. After that, to expand our understanding for the interaction between cell mass and fermentation products as lactate and protease, the effect of the concentration of nitrogen sources as meat extract and peptone on CDM, and the synthesis of lactate and protease were evaluated by using Central Composite Design. Since the growth of alkaliphiles in extreme pH environments often results in low cellular mass, investigating these conditions is crucial for advancing our knowledge. According to experimental results, the highest dry cellular mass was obtained at 1.2 % meat extract and 3.8% peptone in the presence of glucose. The maximum titer of lactate occurred at 2.275 % meat extract and 1.325 % peptone, while the highest protease titer was achieved at 1.5 % meat extract and 0.4 % peptone. Due to the relationship between CDM, and protease and lactate synthesis, we employed Linear, Quadratic, and Purequadratic models to describe the behavior of the system, enabling predictions. Additionally, Multi-objective optimization was used to determine the relationship between two metrics as CDM-Lactate titer, CDM-Protease activity, and Lactate Titer-Protease activity simultaneously, as optimal conditions varied for each variable. Additionally, based on the capability of B. marmarensis for alkaline protease production, this work explores the valorization of various agro-industry byproducts, such as soybean meal, wheat bran waste, alfalfa hay, sunflower seeds waste, corn meal, and sugar beet waste, through the evaluation of alkaline protease production by B. marmarensis. Among the waste materials examined, soybean meal, sunflower seeds waste, and corn meal exhibited alkaline protease production. To our knowledge, this is the first work to investigate both the relationship between cell mass, and fermentative products of Alkalihalobacillus marmarensis, along with the utilization of agro-industry byproduct by this bacterium belongs to the newly introduced genus.
B. marmarensis fi̇zyoloji̇si̇ ve PHB üreti̇mi̇ni̇n opti̇mi̇zasyonu üzeri̇ne bi̇r keşi̇f çalışması
Keywords: alkalin proteaz; alkaline protease; Bacillus marmarensis; Bioengineering; Biyomühendislik; food wastes; gıda atıkları; lactate; laktat; PHB production; PHB üretimi