Development and optimization of purification processes for hyaluronic acid - Buldağ, Özge (My University, 2020)
Hyaluronik asit (HA), yüksek biyouyumluluğu, toksik olmaması ve nem tutma kabiliyeti nedeniyle, kozmetik, ilaç endüstrisi ve tıbbi uygulamalarda yaygın olarak kullanılan en önemli makro moleküllerden biridir. Glukuronik asit ve N-asetil glukozamin içeren bir disakkarit olan HA, hayvan dokularının yanı sıra mikrobiyal fermantasyon süreçleri ile de üretilmektedir.Hyaluronik asidin özellikle medikal alanda kullanılabilmesi için, saf HA içerisindeki protein konsantrasyonunun % 0,1 in altında olması gerekmektedir. Bu nedenle, mikrobiyal fermantasyon süreçleri ile üretilen HA’nın saflaştırılması gerekmektedir. Saflaştırma prosesi, hücrelerin parçalanması ile kapsüler HA’nın üretim ortamına salınması, HA’nın çöktürülmesi ve protein safsızlığının uzaklaştırılması adımlarını içermektedir.Tez kapsamında HA'yı ölçmek için bulanıklık analizi ve Karbazol testi gibi analitik yöntemler kullanılmış ve karşılaştırılmıştır. Sonuçlara göre, bulanıklık tayini miktar tayini için en uygun yöntem olarak belirlenmiştir. Sonrasında, mikrobiyal fermantasyon süreçleri ile üretilen HA’nın, göz uygulamalarında kullanılmak üzere saflaştırılma prosesi geliştirilmiş ve optimize edilmiştir. İlk basamak, hücrelerin uzaklaştırılması, kapsüller HA’nın fermantasyon ortamına aktarılası ve HA’nın çöktürülmesidir. Yapılan optimizasyon adımları sonucunda, %0,1 SDS ile muamele sonrasında, etanol ile en yüksek HA saflaştırma verimi elde edilmiştir.Elde edilen HA den protein safsızlığının uzaklaştırılması için üç farklı yöntem- amonyum sülfat ile çöktürme, proteinlerin aktif karbon ile adsorpsiyonu ve iyon değişim kromatografisi- ayrı ayrı ve birlikte uygulanmıştır. %1,0 aktif karbon ve iyon değişim reçinesi muamelesi sonucunda protein miktarı % 82 oranında uzaklaştırılmıştır.

Hyaluronic acid, one of the most important macromolecules, is widely used in cosmetics, pharmaceutical, and medical applications due to its high biocompatibility, nontoxicity, and moisture retention ability. HA includes glucuronic acid and N-acetyl glucosamine and it is produced by microbial fermentation processes as well as animal tissues.In order to use hyaluronic acid in the medical field, the protein concentration in pure HA must be lower than 0.1%. Therefore, HA must be purified in order to obtain a highly pure product. The downstream process of HA produced by microbial fermentation processes includes the disruption of cells for releasing the capsular HA into the production medium, precipitating HA, and removal of protein impurity.Within the scope of the thesis, the analytical methods turbidity assay and carbazole assay were used to quantify HA and compared. According to results, turbidity assay is determined as the most suitable method to quantify HA in fermentation media. Afterward, the purification process of HA produced by microbial fermentation processes was developed and optimized. In the first step, the cells were disrupted and the capsular HA was transferred to cultivation broth. Then HA was precipitated. At the end of the optimization steps, the highest HA purification yield was obtained with ethanol precipitation after treatment with 0.1% SDS.Furthermore, three different protein purification methods of protein precipitation using ammonium sulfate, adsorption of proteins with activated carbon, and ion-exchange chromatography were applied to remove protein impurities. As a result of 1.0% activated carbon and ion exchange resin treatment, 82% of the protein was removed from HA.
Keywords: adsorpsiyon; adsorption; Bioengineering; Biyomühendislik; Hyaluronik asit; ion exhange chromatography; iyon değişim kromatografisi Hyaluronic acid; protein removal; protein uzaklaştırma