Atomistic simulations of the amine acetylation reaction and the covalent inhibition of the enzyme phosphoinositide 3-kinase (PI3K) - Fındık, Volkan (My University, 2022)
Yeni ilaç arayışı için, hedeflendirilmiş kovalent inhibitörler büyük umut vaadeder. Geleneksel tersinir inhibitörlere göre, genişletilmiş alıkonma süresi ve arttırılmış potansiyele sahip olması gibi birçok avantaj sunarlar. Kinaz inhibitörleri, hedeflendirilmiş kovalent inhibitörlerin en yaygın örneğidir. Fosfoinositid-3-kinaz enzimi, onkolojide önemli ilaç hedefidir, çünkü bu enzim, büyüme kontrolü, metabolizma ve translasyon başlatma gibi çeşitli hücre fonksiyonlarının sinyal yolları üzerinde yer alır. Lisin kalıntıları, hedeflendirilmiş kovalent inhibitörler için bir alternatif olarak ilgi çekmektedir. Son zamanlarda, ilk seçici ve tersinir olmayan, ester elektrofilik grubuna sahip, Lys779 kalıntısına hedeflendirilerek fosfoinositid-3-kinaz  enzimini kovalent olarak inaktive eden inhibitörler raporlanmıştır. Bu tezin asıl amacı,söz konusu enzimin, ester inhibitörleri ile kovalent inhibisyon mekanizmasını açıklığa kavuşturmak ve daha iyi aktiviteye sahip yeni inhibitörlerin gelecekteki tasarımına yardımcı olmaktır. Öncelikle, metilamin ile metil, fenil ve p-NO2 fenil asetat arasında sulu ortamda gerçekleşen model reaksiyon için ab initio ve yoğunluk fonksiyonel teorisi hesaplamaları yapılmıştır. Aynı model daha sonra, “ikili-seviye” hibrit QM/ MM moleküler dinamik simulasyonları ile incelendi. “Düşük seviye” seçeneği olarak PM3/ TIP3P ile şemsiye örnekleme QM/ MM simülasyonu aracılığıyla örnekleme yapıldı. Elde edilen yapılar, kuantum mekanik bölgesinin “yüksek seviye” M062X/ 6-311+G(d,p) teori seviyesi pertürbatif düzeltmeleri için kullanıldı ve düzeltilmiş serbest enerji profilleri elde edildi. Sonuçlar, birinci basamakta zwiteriyonik tetrahedral arayapının oluştuğunu göstermiştir. Daha sonraki basamakta ise, yeterince elektrofilik olan esterler için (mesela p-NO2 fenil asetat), zwiteriyonik yapının iyon çifti olarak ayrıştığı ve ardından beklenen ürünlerin oluşumuna neden olan proton transferinin takip ettiği gözlemlenmiştir. Ardından, enzim ortamının mekanizmaya olan etkisini araştırmak için, benzer hesapsal yöntemler enzim için de kullanılmıştır. Önce MD simülasyonları ile enzimin aktif bölge modeli oluşturuldu. Ardından, M062X/ 6-31+G(d,p):PM6 teori seviyesinde ONIOM QM:QM yaklaşımı uygulanarak aktif bölgede gerçekleşen olası reaksiyon mekanizmaları incelendi. Bu hesaplamalar ile, model sistemden elde edilen reaksiyon mekanizmalarının enzim ortamında da gerçekleşip gerçekleşmediği araştırıldı. Daha sonra, elde edilen bilgiler ışığında, model sistem için saptanan “ikili-seviye” dinamik QM/ MM protokolünün aynısı enzim içeren sistem için de uygulandı. Böylece, inhibitörün p-NO2 fenil asetat türevinin, enzimde gerçekleştirdiği kovalent inhibisyona ait serbest enerji profili elde edildi. Hesaplanan reaksiyon bariyeri, varolan deneysel kinetik bulgular ile uyum içinde olup, önerilen teorik yaklaşımı ve elde edilen mekanizmaları doğrulamaktadır. Bu tez çalışması, deneysel olarak önceden test edilmiş inhibitörlerin kovalent inhibisyon mekanizmalarını aydınlatma yoluyla, etkinliği arttırılmış yeni inhibitörlerin keşfedilebilmesi için temel oluşturmaktadır.

Targeted Covalent Inhibitors hold great promise for search of new drugs. They offer a number of potential advantages over traditional reversible inhibitors, such as extended residence time, increased potency, and the ability to make modifications for effective design. Kinase inhibitors are the most common examples of targeted covalent inhibitors. Phosphoinositide 3-kinase enzymes are important drug targets in oncology as they are involved in the signaling pathway for many cellular functions such as growth control, metabolism and translation initiation. Lysine residues have gained increasing interest as an alternative for targeted covalent inhibition. Recently, the first selective and irreversible inhibitors with ester groups as electrophilic head targeting the Lys779 residue and covalently inactivating the PI3K enzyme were reported. The main objective of this thesis is to elucidate the mechanism of the covalent inhibition of PI3K by these ester inhibitors in order to assist future design of new inhibitors with superior activities. Prior to the mechanistic studies on the enzyme, initially, we performed ab initio and DFT calculations on the model reaction between methylamine and methyl, phenyl and p-NO2 phenyl acetates in aqueous solution. The same model systems were then studied by the dual-level QM/ MM molecular dynamics approach. For the “low-level” option, PM3/ TIP3P umbrella sampling QM/ MM simulations were applied for the sampling. The obtained structures were then used to obtain perturbative corrections to the free energy with a “high-level” QM region at the M06-2X/ 6-311+G(d,p) level. The results show that the first step involves the formation of the zwitterionic tetrahedral intermediate. Then, for sufficiently electrophilic esters, such as the p-NO2 derivative, the reaction proceeds by dissociation of the zwitterion as an ion pair, followed by proton transfer leading to the formation of the expected products. We, then, employed similar computational tools to shed light on the mechanistic aspects of the enzyme. First, an active site model of the enzyme was built through classical molecular dynamics simulations. Then, ONIOM QM:QM approach at the M06-2X/ 6-31+G(d,p):PM6 level was applied to get possible reaction mechanisms in this active site. These calculations guided us to refine the reaction mechanisms in enzyme environment which globally confirm the steps obtained from the small model system. We finally used this information to approach a dynamic QM/ MM study on the enzyme using the same “dual-level” protocol established for the small model system, which allowed us to obtain the free energy profile of the inhibition mechanism of PI3K for p-NO2 derivative of the ester inhibitor. The calculated barrier is in good agreement with the available experimental kinetic data, which validates the proposed theoretical approach and the obtained mechanisms. Through the elucidation of the inhibition mechanism of previously experimentally tested compounds, our study paves the way for the discovery of new inhibitors with improved activity with the help of theoretical chemistry tools.
Amin asetillenme reaksiyonunun ve fosfoinositid-3-kinaz (PI3K) enziminin kovalent inhibisyonunun atomistik simülasyonları
Keywords: Chemistry; Chemistry, Organic; Covalent Inhibition; Kimya; Kimya, Organik; Kovalent İnhibisyon; ONIOM; PI3K Enzimi; PI3K Enzyme; QM/ MM Simulations; Quantum Mechanic Calculations QM/ MM Simülasyonları; Quantum Mekanik Hesaplamaları; Şemsiye Örnekleme; Umbrella Sampling