Fermantation performances of amylolytic nuclear petite Saccharomyces cerevisiae integrands developed for bioethanol production - Köşebent, Deniz (My University, 2010)
BİYOETANOL ÜRETİMİ İÇİN GELİŞTİRİLMİŞ OLAN AMİLOLİTİK Saccharomyces cerevisiae SUŞLARININ FERMENTASYON PERFORMANSLARININ DEĞERLENDİRİLMESİ Bu tez çalışması, nişasta içerikli kaynaklardan birinci ve ikinci nesil biyoetanol üretimi işlemlerinde kullanılmaya uygun amilolitik Saccharomyces cerevisiae suşu geliştirmek amacı ile sürdürülen araştırmanın bir bölümünü oluşturmaktadır. Araştırma kapsamında geliştirilmiş olan tüm suşlarda amilolitik aktivitenin ekspresyonu plazmidler ile sağlanmıştır. Düşük mitotik kararlılığa sahip bu plazmidlerin neden olduğu etanol verim kayıplarının önlenmesi amacı ile yeni bir strateji uygulanmıştır. Bu stratejide, amilaz genlerinin S. cerevisiae genomik DNA sına çoklu entegrasyonu amaçlanmış ve bu doğrultuda bir DNA kasedi oluşturulmuştur. Bu çalışmada ise, DNA kasedinin, solunum yapamayan (nuclear petite) S. cerevisiae FY23Δpet191 ve solunum yapabilen (grande) S. cerevisiae FY23 hücrelerine entegrasyonu sağlanmış ve iyi amilolitik aktivite gösteren ikişer adet grande (WTB ve WTŞ) ve nuclear petite (NPU ve NPZ) entegrandı seçilmiştir. Bu suşların kesikli çalkalamalı ortamdaki fermentasyon özellikleri plasmid içeren kültürler (NPB-G ve WTPB-G) ile karşılaştırılmıştır. Genel olarak, solunum yapabilen entegrandların nişasta tüketim ve etanol üretimlerinin, solunum yapamayanlardan daha iyi olduğu belirlenmiş ve gene bu entegrandların NPB-G kültürlerine göre yaklaşık 100 kat α-amilaz ve 20 kat glukoamilaz aktivitesi salgıladıkları bulunmuştur. Ayrıca, tüm entegrandların mısır ve buğday nişastalarını sırasıyla %100 ve %70 oranlarında kullandıkları belirlenmiştir. Grande entegrandların işlenmemiş nişasta kaynaklarına karşı yüksek amilolitik aktivite göstermesi üzerine, bu suşların ikinci nesil biyoetanol üretiminde kullanılma potansiyeli gösterdikleri düşünülmüş ve nişasta içerikli tarımsal atık kaynağı olarak kullanılan patates kabuklarının entegrandlar tarafından parçalanmış olması ise bu düşünceyi desteklemiştir. Sıralı inokülasyon ile, plasmid bazlı WTPB-G suşundan elde edilmiş olan alt kültürlerin amilolitik aktivitesinin daha ilk aşamalarda düştüğü, grande entegrant alt kültürlerinin amilolitik aktivitesinin ise sabit ve kararlı şekilde korunduğu belirlenmiştir.

FERMENTATION PERFORMANCES OF AMYLOLYTIC NUCLEAR PETITE Saccharomyces cerevisiae INTEGRANDS DEVELOPED FOR BIOETHANOL PRODUCTION This thesis is part of an ongoing research that aims to develop amylolytic S. cerevisiae strains that can efficiently metabolize starchy substrates and hence be utilized in fermentation systems for first and second generation bioethanol production. Within the scope of this research, so far, in all the developed strains, multi copy plasmids were used for the expression of the amylolytic enzymes. In order to obviate the observed decrease in amylolytic activity and hence ethanol productivity due to the poor mitotic stability of these plasmids under nonselective conditions, a new strategy has been applied that involved multi copy integration of the amylase genes into S. cerevisiae genomic DNA. For this, a DNA cassette was constructed. In this study, both respiratory deficient (nuclear petite) S. cerevisiae FY23Δpet191 and respiratory sufficient (grande) S. cerevisiae FY23 strains were transformed with the constructed DNA cassette. The two grande (WTB and WTŞ) and nuclear petite integrands (NPU and NPZ) were selected based on leucine auxothrophy and amylolytic activity and verified by PCR. The fermentation performances of these integrand strains were evaluated by analyzing important fermentation parameters of shake flask cultures and comparing them with those of the plasmid harboring cultures (NPB-G and WTPB-G). Generally, respiratory sufficient integrands were found to be superior to the nuclear petite ones in terms of starch consumption and ethanol productivity. Grande integrands were found to excrete about hundred-fold (α-amylase) and twenty-fold (glucoamylase) higher amylolytic activities when compared with the NPB-G cultures. Moreover, grande and nuclear petite integrands were found to utilize corn and wheat starches up to 100% and 70%, respectively. High amylolytic activity of the grande integrand against raw starch substrates suggested its potential use for 2G bioethanol processes. Preliminary experiments where potatoe shells were used as starchy agro waste resource, supported this fact. Finally, serial subculturing experiments revealed the stable maintenance of the amylolytic activity in the grande integrands whereas the plasmid based system has lost the amylolytic genes within the first few subcultures.
Keywords: Biyoetanol; Biyomühendislik; Fermentasyon