Investigation of penetration of inhibitor into cells and their interactions with intracellular proteins/ metabolites - Buldum, Gizem (My University, 2011)
İNHİBİTOR HÜCRE İÇİNE GİRİŞİ VE HÜCREİÇİ PROTEİNLERLE / METABOLİTLERLE ETKİLEŞİMLERİNİN ARAŞTIRILMASI β-laktam antibiyotikleri, yüksek etkinlik ve düşük maliyet gibi özellikleri sebebiyle çok yaygın şekilde kullanılan antimikrobiyal maddelerdir. Yaygın kullanımları, bakterilerin antibiyotiklere karşı direnç kazanmasına ve giderek büyüyen bir halk sağlığı problemi haline gelmesine sebep olmuştur. Direnç mekanizmalarından en sık görüleni bakterilerin β-laktamaz enzimi üreterek antibiyotiği etkisiz hale getirmesidir. Bu nedenle, β-laktam antibiyotiklerinin tedavi edici etkisinin sürdürülebilmesi için β-laktamaz inhibitörleri önemli bir araştırma konusu haline gelmiştir. Streptomyces clavuligerus, tarafından üretilen β-laktamaz inhibitör proteini (BLIP) ve BLIP’ in yapısı temel alınarak oluşturulan peptitler β-laktamaz enzimini inhibisyon özelliğine sahiptirler. Bu bilgiler ışığında, bu çalışmada in-vitro ve in-vivo metotlar kullanılarak β-laktamazın BLIP ve BLIP yapısı temel alınarak oluşturulan peptitler tarafından inhibisyonu incelenmiştir. In-vivo inhibisyon deneylerinde R-TEM-1 β-laktamaz ve inhibitörü olan BLIP’ in berbaber ekspresyonu pUC18 ve pET-26SJ vektörleri ile E. coli BL21(DE3) hücrelerinde sağlanmıştır. BLIP’in varlığında, periplazmadaki toplam β-laktamaz aktivitesi %95 azalmıştır. BLIP’ in üretimi canlı hücre sayısı başına düşen β-laktamaz aktivitesinde 35 kat düşüşe sebep olmuştur. BLIP ve BLIP- β-laktamaz kompleksinin varlıkları sırasıyla SDS ve Native-PAGE analizleriyle doğrulanmıştır. BLIP’in yapısı temel alınarak oluşturulan peptitle ile in-vivo inhibisyon çalışmaları yapmak amacıyla, pUC18 plazmidi taşıyan E. coli hücreleri inkübe edilmiş, fakat peptitlerin inhibe edici özelliği gözlenememiştir. In-vitro inhibisyon çalışmalarında BLIP’ in periplazmik sıvıdaki β-laktamazı %69 ve ticari β-laktamazı %80 oranında inhibe ettiği saptanırken, peptitlerin güçlü bir in-vitro inhibisyon etkisi gözlenememiştir.

INVESTIGATION OF PENETRATION OF INHIBITOR INTO CELLS AND THEIR INTERACTIONS WITH INTRACELLULAR PROTEINS/ METABOLITES β-lactam antibiotics are the most widely utilized antimicrobials by virtue of their high efficacy and low cost. Owing to the widespread usage, bacteria acquire resistance to these antibiotics and cause a growing public health problem. The most prevalent bacterial resistance mechanism to β-lactam antibiotics is the production of β-lactamases to render the antibiotic inactive. In this context, β-lactamase inhibitors emerge as an important research field to continue the therapeutic value of antibiotics. β-lactamase inhibitor protein (BLIP), which is produced by Streptomyces clavuligerus, and BLIP derived peptides have inhibition potential against β-laktamase enzymes. In this study, in-vitro and in-vivo methods have been used to investigate β-lactamase inhibition by BLIP and BLIP derived peptides. In-vivo binding experiments have been performed with E. coli BL21(DE3) cells harboring both pUC18 and pET-26SJ vector for simultaneous expression of R-TEM-1 β-lactamase and BLIP. In the presence of BLIP, β-lactamase activity found in periplasm decreased 95%. Induction of BLIP production led to a 35 fold decrease in β-lactamase activity per viable cell. The presence of BLIP and BLIP-β-lactamase complex in the periplasmic fraction were verified by SDS-PAGE and Native-PAGE analysis respectively. In order to investigate in-vivo enzyme inhibition by BLIP derived peptides, E. coli K12 cells harboring pUC18 were incubated with the peptides, but no growth inhibition has been observed. While BLIP inhibited the crude β-lactamase and commercial β-lactamase 69% and 80% respectively, no strong in-vitro inhibition has been observed by peptides.
Keywords: Biyomühendislik; Hücreiçi Proteinler