Glipizidin adipositlerde glikoz hemostazı ve dna hasarına etkilerinin moleküler seviyede araştırılması - Çaker, Selen (My University, 2018)
ÖZETGLİPİZİDİN ADİPOSİTLERDE GLİKOZ HEMOSTAZI VE DNA HASARINA ETKİLERİNİN MOLEKÜLER SEVİYEDE ARAŞTIRILMASITip 2 diyabet en yaygın görülen metabolizma hastalıklarından biridir. Dünyada tanı konulan diyabet vakalarından %90-95’isini tip 2 diyabet oluşturmaktadır. Özellikle yaşlanma ile diyabet sıklığı artmaktadır ve diyabetli olmayan yaşıtlara kıyasla kardiyovasküler olay riski, tip 2 diyabetli kişilerde 2-4 kat daha yüksektir. Diyabet; körlük, son dönem böbrek yetersizliği ve travma-dışı amputasyonların en önemli nedeni olarak gösterilmektedir. Hastalık ve özellikle komplikasyonlarının tedavi maliyetlerinin yüksek olması nedeniyle diyabetli oranı yüksek ülkelerde sağlık harcamaları daha yüksek olmakta, üretkenlik azalmakta ve ülke ekonomisi de olumsuz yönde etkilenmektedir.Çalışmamızda tip 2 diyabet tedavisinde kullanılan bir ilaç olan glipizidin, olgun ve yaşlı adipositler üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Yağ dokunun insülin direnci ve metabolik sendromun bileşenlerinin klinik anlatımı açısından önemli bir rol üstlendiği kabul edildiği için çalışmamızda, 3T3-L1 adiposit hücre soyları kullanılmıştır. Kültüre alınan hücreler, etkin ve letal dozları iCELLigence sistemiyle tespit edilen glipizid ile muamele edilerek hücrelerin olgun ve yaşlı safhalarında RAN geni anlatımı düzeyleri tespit edilmiştir.Gerçek zamanlı hücre monitorizasyon sistemi kullanılarak glipizidin farklı dozlarına olgun adipositlerin verdiği cevap incelenmiştir. 100 μM, 250 μM ve 500 μM glipizidin olgun adipositler üzerindeki etkisi 96 saat boyunca 15’er dakikalık periyotlarda ölçüm alınarak gözlemlenmiştir. Elde edilen proliferasyon eğrilerinden yararlanılarak IC50 değerleri hesaplanmıştır. Glipizid uygulanan tekli kültür dozları karşılaştırıldığında 24. saatteki IC50 değeri 180 μM olarak belirlenmiştir.Olgun adipositlerde glipizid uygulaması yapılan hücrelerde RAN geni anlatımı kontrole göre yüksek bulunmuştur. Olgun ve yaşlı kontrol hücreleri karşılaştırıldığında, yaşlı hücrelerde RAN geni anlatımının daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. RAN genivianlatımının yüksek bulunması, glipizidin glikoz hemostazında düzenleyici bir etkiye sahip olduğunu gösterebilir. Yaşlı adipositlerde glipizid uygulaması yapılan hücrelerde RAN geni anlatımı kontrole göre düşük bulunmuştur. Glipizid uygulanmış olgun ve yaşlı adipositler karşılaştırıldığında, yaşlı hücrelerde RAN geni anlatımının daha düşük olduğu görülmüştür.Glipizidin olgun ve yaşlı adipositlerde DNA hasarına olan etkisinin araştırılması için Komet Analizi kullanılmıştır. Bu analiz ile adiposit DNA’larında meydana gelen hasarlar kuyruk şeklinde kayma göstererek gözlemlenmiştir. 180 μM glipizid uygulanan olgun adipositlerde kendi kontrol grubuna göre daha yüksek oranda DNA hasarı oluştuğu görülmüştür. Olgun adipositler ve yaşlı adipositlerin kontrol grupları karşılaştırıldığında, yaşlı adipositlerde DNA hasarının glipizidden bağımsız olarak daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. 180 μM glipizid uygulanan yaşlı adipositlerde kendi kontrol grubuna göre daha fazla DNA hasarı oluştuğu tespit edilmiştir. Tip 2 diyabet tedavisinde kullanılan glipizidin olgun ve yaşlı adipositlerde DNA hasarı meydana getirdiği belirlenmiştir.Yapılan literatür taramalarında, glipizidin olgun ve yaşlı adipositlerde karşılaştırmalı olarak RAN geni ekspresyonları ve DNA hasarına etkilerini rapor etmiş bir çalışmaya rastlanmamıştır. Deneyimiz bu alanda özgün bir çalışma olma niteliği taşımaktadır.Mart 2018 Selen ÇAKERİÇİNDEKİLER SAYFATEŞEKKÜR (ACKNOWLEDGEMENT) iİÇİNDEKİLER iiÖZET vABSTRACT viiSEMBOLLER (SYMBOLS) ixKISALTMALAR (ABBREVIATIONS) xiŞEKİL LİSTESİ (LIST OF FIGURES) xiiiTABLO LİSTESİ (LIST OF TABLES) xv1. GİRİŞ 11.1. yabet 11.1.2. Tip 2 Diyabet 11.1.3. Sülfonilüreler 21.1.4. Glipizid 31.1.5. Yağ Doku 31.1.6. Adipositler ve Glikoz Hemostazı İlişkisi 41.1.7. Tip 2 Diyabetlilerde DNA Hasarı 51.1.8. RAN Geni 61.1.9. RAN Geni ve Glikoz Hemostazı İlişkisi 71.1.10. Yaşlanma ve Beta-Galaktosidaz İlişkisi 71.1.11. Amaç ve Hedefler 82. MATERYAL ve YÖNTEM 112.1. Materyal 112.1.1. Kullanılan Kimyasal Malzemeler 11iii2.1.2. Kullanılan Araç ve Gereçler 132.2. Yöntem 142.2.1. Çalışma Grubu 142.2.2. Hücre Kültürü 142.2.3. 3T3-L1 Fibroblast Hücrelerinin Olgun ve Yaşlı Adiposit HücrelerineDönüştürülmesi 172.2.4. Adipositlerin Oil Red O Boyama ile Tespiti 192.2.5. iCELLigence Sistemi ile 3T3-L1 Adiposit Hücre SayısınınOptimizasyonu 202.2.6. iCELLingence Sisteminde 3T3-L1 Adiposit Hücrelerine GlipizidUygulanması 222.2.7. Total RNA İzolasyonu 232.2.8. Total RNA’dan cDNA Sentezi 242.2.9. Kantitatif Polimeraz Zincir (qPZR) Analizi 242.2.10. Beta-Galaktosidaz (β-Galaktosidaz) Testi 242.2.11. Komet Analizi 262.2.12. İstatistiksel Analizler 283. BULGULAR ve TARTIŞMA 293.1. Bulgular 293.1.1. Glipizidin 3T3-L1 Adiposit Çoğalması Üzerine Etkileri 293.1.2. Beta-Galaktosidaz (β-Galaktosidaz) Testi ile YaşlanmanınGözlenmesi 303.1.3. 180 μM Glipizid Uygulaması Yapılan Olgun ve Yaşlı AdipositlerdeRAN Geni Anlatımı 313.1.4. Komet Analizi Parametreleri 33iv3.2. Tartışma 384. SONUÇLAR 41KAYNAKLAR 45ÖZGEÇMİŞ

ABSTRACTEVALUATION OF THE EFFECTS OF GLIPIZIDE ON GLUCOSE HOMEOSTASIS AND DNA DAMAGE IN ADIPOCYTES AT MOLECULAR LEVELType 2 diabetes is one of the most common metabolic disease. 90-95% of diagnosed cases of diabetes in the world constitutes type 2 diabetes. The incidence of diabetes increase with aging. Compared to non-diabetic people at the same age, the risk of cardiovascular events in people with type 2 diabetes are 2-4 times higher. Diabetes is cited as the most important reasons for blindness, end-stage renal failure and non-traumatic amputations. Medical expenses are higher, productivity is decreased and economics is affected negatively in countries with high diabetes rates.Effects of glipizide, a drug used in the treatment of type 2 diabetes, on mature and aged adipocytes was investigated in our study. We used 3T3-L1 adipocyte cell lines which it’s importance is known as the adipose tissue is considered playing an important role in insulin resistance and the clinical expression of components of the metabolic syndrome. The cultured cells were treated with glipizide with the doses that are detected using the iCELLigence system. Then RAN gene expression levels of cells in mature and old stage were determined.The response of mature adipocytes to different doses of glipizide was investigated using a real-time cell monitoring system. 100 μM, 250 μM and 500 μM glipizide on mature adipocytes were monitored for 96 hours at 15 minute intervals. IC50 values were calculated using the obtained proliferation curves. The IC50 value at 24 hours was determined as 180 μM for the cells that were treated with drug.RAN gene expression was higher in glipizide treated cells in mature adipocytes than in controls. When mature and old control cells were compared, RAN gene expression was found to be higher in old cells. The high expression of the RAN gene expression may indicate that glipizide has a regulatory effect on glucose homeostasis. RAN gene expression in glipizide-treated cells in old adipocytes was lower than controls.viiiCompared with mature and old adipocytes treated with glipizide, RAN gene expression was lower in old cells.The Comet Assay was used to investigate the effect of glipizide on DNA damage in mature and old adipocytes. With this analysis, adipocyte DNA damage was observed as a tail-like shift. Mature adipocytes treated with 180 μM glipizide were found to have higher DNA damage than their control group. When control groups of mature adipocytes and old adipocytes were compared, we found that DNA damage was higher in old adipocytes independently of glipizide. Old adipocytes treated with 180 μM glipizide were found to have more DNA damage than their control group. It has been determined that glipizide, used in the treatment of type 2 diabetes, was detected to cause DNA damage in both mature and old adipocytes.We did not observe any research in the literature reporting the effects of glipizide on RAN gene expression and DNA damage in mature and old adipocytes. Our experiment is characteristic of being an original work in this area.March 2018 Selen ÇAKERİÇİNDEKİLER SAYFATEŞEKKÜR (ACKNOWLEDGEMENT) iİÇİNDEKİLER iiÖZET vABSTRACT viiSEMBOLLER (SYMBOLS) ixKISALTMALAR (ABBREVIATIONS) xiŞEKİL LİSTESİ (LIST OF FIGURES) xiiiTABLO LİSTESİ (LIST OF TABLES) xv1. GİRİŞ 11.1. yabet 11.1.2. Tip 2 Diyabet 11.1.3. Sülfonilüreler 21.1.4. Glipizid 31.1.5. Yağ Doku 31.1.6. Adipositler ve Glikoz Hemostazı İlişkisi 41.1.7. Tip 2 Diyabetlilerde DNA Hasarı 51.1.8. RAN Geni 61.1.9. RAN Geni ve Glikoz Hemostazı İlişkisi 71.1.10. Yaşlanma ve Beta-Galaktosidaz İlişkisi 71.1.11. Amaç ve Hedefler 82. MATERYAL ve YÖNTEM 112.1. Materyal 112.1.1. Kullanılan Kimyasal Malzemeler 11iii2.1.2. Kullanılan Araç ve Gereçler 132.2. Yöntem 142.2.1. Çalışma Grubu 142.2.2. Hücre Kültürü 142.2.3. 3T3-L1 Fibroblast Hücrelerinin Olgun ve Yaşlı Adiposit HücrelerineDönüştürülmesi 172.2.4. Adipositlerin Oil Red O Boyama ile Tespiti 192.2.5. iCELLigence Sistemi ile 3T3-L1 Adiposit Hücre SayısınınOptimizasyonu 202.2.6. iCELLingence Sisteminde 3T3-L1 Adiposit Hücrelerine GlipizidUygulanması 222.2.7. Total RNA İzolasyonu 232.2.8. Total RNA’dan cDNA Sentezi 242.2.9. Kantitatif Polimeraz Zincir (qPZR) Analizi 242.2.10. Beta-Galaktosidaz (β-Galaktosidaz) Testi 242.2.11. Komet Analizi 262.2.12. İstatistiksel Analizler 283. BULGULAR ve TARTIŞMA 293.1. Bulgular 293.1.1. Glipizidin 3T3-L1 Adiposit Çoğalması Üzerine Etkileri 293.1.2. Beta-Galaktosidaz (β-Galaktosidaz) Testi ile YaşlanmanınGözlenmesi 303.1.3. 180 μM Glipizid Uygulaması Yapılan Olgun ve Yaşlı AdipositlerdeRAN Geni Anlatımı 313.1.4. Komet Analizi Parametreleri 33iv3.2. Tartışma 384. SONUÇLAR 41KAYNAKLAR 45ÖZGEÇMİŞ
Keywords: 3T3-L1 adipocyte; 3T3-L1 adiposit; adipogenesis; adipogenez; Biology, Medical; Biyoloji, Tıbbi; Comet assay; Diabetes; Diabetes--- DNA damage; Diyabet; DNA hasarı; iCELLigence sistemi; iCELLigence system; Komet analizi RAN; Metabolic diseases; Metabolizma hastalıkları; RAN