Haloarcula hispanica’ya ait proteaz enzimlerinin escherichia coli’de rekombinant olarak üretilmesi ve analizi - Güneş, Ayşenur (My University, 2019)
Amaç: Farklı organizmalardan elde edilen proteolitik enzimler endüstrinin değişik alanlarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında, ekstremofil özellik gösteren ve çoğalmak için özel koşullar gerektiren H. hispanica’ya ait proteaz genlerini, üretilmesi daha kolay ve ucuz olan Escherichia coli hücrelerine aktarmak, bu hücrelerde proteaz enzimlerini rekombinant olarak üretmek ve proteolitik aktivitelerini analiz etmek amaçlandı.Gereç ve Yöntem: H. hispanica genomunda proteaz ve serin proteaz geni okuma çerçevesi olarak tanımlanan DNA bölgeleri PZR tekniği ile çoğaltıldı ve E. coli hücreleri için geliştirilen, farklı kontrol bölgelerine sahip plazmit vektörlere (pET-14b, pBluescript II SK+ ve pAK-Taq) klonlandı. Klonlanan genlerin doğrulukları DNA dizi analizleri ile saptandı. Rekombinant proteaz enzimlerinin E. coli hücrelerinde sentezi SDS-PAGE teknikleri ile analiz edildi. Enzim aktiviteleri, hücrelerin milk-agar besiyerinde oluşturdukları üreme zonlarına ve hücrelerden hazırlanan lizatların BSA’yı ve/ veya azokazein substratı hidroliz etme özelliklerine bakılarak değerlendirildi.Bulgular ve Sonuç: Farklı promotör dizileri kontrolünde klonlanan H. hispanica proteaz genlerinin nukleotit dizilerinin doğruluğu DNA dizi analizleri ile ortaya kondu. H. hispanica proteaz geninin denenen farklı E. coli suşlarında istenilen düzeylerde ekspresyon yapmadığı görüldü. Buna karşın serin proteaz geninin T7 bakteriyofaj promotörü kontrolünde, E. coli BL21 hücrelerinde, diğer hücresel proteinleri ile karşılaştırıldığında yüksek düzeylerde ekspresyon yaptığı saptandı. Bununla birlikte rekombinant serin proteazın hücrelerde inaktif inklüzyon cisimleri halinde biriktiği belirlendi. Rekombinant serin proteazın çözünür forma dönüştürülmesinde kısmen başarı sağlansa da, istenilen düzeylerde enzim aktivitesi saptanamadı. E. coli hücrelerinde etkin olarak sentezlenen H. hispanica serin proteaz enziminin tekrar aktif forma katlanmasına yönelik çalışmalar sürdürülmektedir.

Aim: Proteolytic enzymes isolated from different organisms are widely used in a various fields of the industry. In this thesis, it was aimed to transfer the protease genes of extremophilic Haloarcula hispanica to Escherichia coli that is easier ve cheaper to produce, recombinantly produce the proteases ve to analyze their proteolytic activities.Materials ve Methods: The DNA fragments described as proteases open reading frame on H. hispanica genome were amplified by PCR ve cloned into the E. coli plasmids (pET-14b, pBluescript II SK + ve pAK-Taq) having different control elements. Accuracy of the genes was determined by DNA sequencing. Recombinant proteases synthesed in E. coli was analyzed by SDS-PAGE techniques. Enzyme activities were evaluated by checking of hydrolysis of the BSA ve/ or azokazein with the cell lysates ve the zones of cells growing on milk-agar medium.Results ve Conclusion: The accuracy of the H. hispanica proteases genes cloned under the control of different promoters was demonstrated by DNA sequencing. H. herpanica protease gene did not express at the desired levels in the different E. coli strains tested. In contrast, the serine protease gene under the control of T7 promoter was expressed at high level comparing with other cellular proteins in E. coli BL21. However, it was determined that the recombinant serine protease accumulates as inactive inclusion bodies in the cells. Although it was partially successeded in converting the recombinant serine protease to the soluble form, the desired enzyme activity could not be detected. Efforts are going on to refolding of the serine protease into the active form, which is effectively synthesized in E. coli cells.
Keywords: H. hispanica; Halofilik; Halophilic; Protease; Proteaz; Recombinant; Rekombinant Serine Protease; Serin Proteaz