Monoamin oksidaz (MAO) enziminin aminleri oksitleme mekanizmasının hesapsal yöntemlerle incelenmesi - Karahan, Özlem (My University, 2004)
MONOAMİN OKSİDAZ(MAO) ENZİMİNİNİN AMİNLERİ OKSİTLEME MEKANİZMASININ HESAPSAL YÖNTEMLERLE İNCELENMESİ Monoamin Oksidaz (EC 1.4.3.4; MAO) flavin kofaktörü ihtiva eden ve biyolojik aminleri oksitleyerek imine dönüştüren bir enzimdir. Seratonin, dopamin, norepinefrin, epinefrin gibi nörotransmitterler bu enzimin substratları arasındadır. MAO'ın MAO-A ve MAO-B olmak üzere iki formunun olduğu bilinmektedir. Her iki şeklinin de aminleri oksitleme mekanizmasının aynı olduğu sanılmakta ancak oksitleme mekanizması tam olarak bilinmemektedir. Bu enzimi inhibe eden bileşikler ise Parkinson hastalığı ya da depresyon tedavilerinde ilaç olarak kullanılmaktadır. Literatürde temel olarak dört mekanizma önerilmiştir. Bu çalışmada ise yeni gelişmeler sonrasında önerilen tek basamaklı radikal mekanizması incelenmiştir. Önerilen radikal mekanizması aminin eşleşmemiş elektronlarından birinin, enzimin aktif bölgesindeki flavin halkasının C-4a atomuna saldırısıyla başlar.(Şekil II.15.) Aynı adımda flavinin N-5 atomu, aminin a-karbonundaki protonuna saldırır ve a-H'de elektronlarını bağlı olduğu C üzerine bırakıp N-5 atomuna bağlanır. Oluşacak amin radikal araürünü çok kararsız olduğundan atlanarak C üzerindeki elektronlardan biri derhal amin azotuna giderek oradaki yalnız elektronla eşlenir. Azotdaki elektron çiftinin C atomuna doğru kapaklanmasıyla karbon atomu üzerinde kalmış olan tek elektron flavine transfer olur ve C-4a daki tek elektron ile eşleşir. Kısacası, amin imonyum katyonuna dönüşürken flavin indirgenmiş olur. Sonraki basamakta imonyum katyonu hidroliz olup aldehide dönüşür. İndirgenmiş flavin oksijen vasıtasıyla tekrar yükseltgenir. Bu tezde, monoamin oksidaz enziminin tek elektron transferi ile aminleri oksitleme mekanizması hesapsal yöntemlerle modellenmiştir. Hesaplamalarda yarı-ampirik metotlardan PM3 yöntemiyle modelleme yapıldı. Substrat olarak deneysel hız sabitleri bilinen p-sübstitüe benzil aminler kullanıldı. Enzimin tamamı modellenemeyeceği için reaksiyonun gerçekleştiği aktif bölgedeki flavin reaktantlardan biri olarak seçildi. Her bir basamaktaki reaktantların, geçiş konumlarının, araürünlerin yapıları ve enerjileri incelendi. Basamakların aktifleşme enerjileri, hız sabiti, her bir molekülün bağ uzunlukları, atom yükleri ve atomik spin yoğunlukları hesaplanıp karşılaştırıldı. Mekanizmayı sulu ortamda da inceleme girişimimiz ise PM3 metodunun sulu ortamda radikal yapıları hesaplayamamasından dolayı gerçekleştirilemedi. Ancak DFT yönteminden B3LYP/ 6-31G* kullanarak sulu ortamda reaksiyon enerjisi hesaplanabilmiştir. Hesaplanan hız sabitlerinin literatürde MAO-A ve MAO-B için kinetik deneylerden tespit edilen değerleri ayrı ayrı ilişki grafikleri çizilmiştir. Radikal mekanizmanın her iki MAO ile de bir ilişkisi görülmemiştir. Diğer bir tez çalışmasında incelenen polar nükleofilik mekanizma MAO-A hızları ile iyi ilişki vermiş(R2=0,86), ancak MAO-B ile çok düşük bir ilişki vermiştir. (R2=0,38) Bütün bu bilgiler birleştirildiğinde MAO-A'nın aminleri radikal yolla değil, polar nükleofilik mekanizma ile oksitlediği anlaşılmaktadır. MAO-B için ise herhangi bir yargıya varmak için yeterli bulgu elde edilememiştir. Haziran 2004 Özlem KARAHAN

INVESTIGATION OF AMINE OXIDATION MECHANISM OF MONOAMINE OXIDASE(MAO) ENZYME BY COMPUTATIONAL METHODS Monoamine Oxsidase (EC 1.4.3.4; MAO) is a flavoenzyme that catalyzes the oxidation of biogenic amines; such as tryptamine, serotonin, dopamine, norepinephrine, epinephrine. It is known that MAO exists in two different isozymic forms; MAO-A and MAO-B. It is believed that both forms oxidate the substrates by the same mechanism. However the exact mechanism is not completely understood. MAO inhibitors have been used clinically for the treatment of Parkinson's disease and depression. Four mechanisms were proposed for the oxidation of MAO in the literature. In this work, a concerted radical mechanism, proposed recently was investigated. In this proposed mechanism, the initial reaction starts with one electron from the N lone pair to the C-4a atom of the flavin ring(Scheme II.15). At the same step, the N-5 atom of the flavin abstracts a-carbon's proton leaving the electrons on a-carbon. The unstable amine radical picks one of the electrons from a-carbon generating a-carbinyl radical. Later on, a-carbinyl radical couples with the C-4a radical forming a covalent bond. The next step is the cleavage of this bond with the aid of N lone pair electron of amine substrate. (These two steps may occur concerted via a mechanism). As a result flavin was totally reduced with the oxidation of amine substrate. Immonium ion undergoes hydrolysis reaction non-enzymatically producing aldehyde product. The reduced flavin was oxidized with molecular oxygen back to the oxidizied form. In this study single electron transfer reaction of amine oxidation was modeled by compational methods. In our calculations, PM3 method which is one of the semi-emprical methods was used. Para benzylamines whose rate constant was known from kinetic experiments, were chosen as substrates. It was not possible to include the whole enzyme in our calculation method so we just considered took the flavin part of the enzyme as one of the reactants. At each step, the structures and the energies of the reactants, their corresponding transition state, and intermediates were investigated. For each reaction, activation energies, rate constants, bond distances, atomic charges and atomic spin densities of each molecule were calculated and compared. We were not able to carry out the radical reactions in aqeuous solutions since the PM3 method is not accessible for this purpose. However, DFT B3LYP/ 6-31G* method was used to calculate only the reaction energies in aqeuous solution. Correlation graphics between experimentally determined MAO-A and MAO-B rate constants and the calculated rate constants have been drawn. No relationship has been found between the radical mechanism and both forms of MAO. In another previous thesis study, the polar nucleophilic mechanism was investigated with PM3 method and showed good correlation (R2=0.86), with the experimental rate constants of MAO-A but very low correlation (R2=0.38) with MAO-B. When these results are combined, we predict that MAO-A oxidizes the amines with polar nucleophilic mechanism and not with the radical mechanism. For MAO-B, there is not enough information to predict the oxidation mechanism. June 2004 Özlem Karahan
Keywords: Enzimler; Organik Kimya