Sistemik mikozlularla genel hasta gruplarından ve doğadan ayırıp tanımladığımız mantarların antifungallere duyarlılıklarının karşılaştırılması - Kantarcıoğlu, A. Serda (My University, 2001)
Son zamanlarda mantarlar ve bunlarla, özellikle doğadaki fırsatçı mantarlarla oluşan hastalıkların önem kazandığı; antifungallere dirençli kökenlerin tedavide sorun oluşturduğu; buna paralel olarak klinikle uyumlu, tekrarlanabilir, güvenilir sonuçlar veren standartlaştırılmış duyarlılık deneyi yöntemlerine ilginin arttığı dikkati çekmektedir. Direnç sorununu azaltabilmek için derin mikoz laboratuvarlarında klinik örneklerden ayrılan etkenin doğru tanımlanması ve antifungal duyarlılık deneylerinin yapılması önerilmektedir. Bütün bu önem kazanan noktalar dikkate alınarak bu tezde, sistemik mikozlulardan, genel hasta gruplarından ve doğadan ve kontrol grubu olarak sağlıklı bireylerden elde edilen mantarların çeşitli antifungallere duyarlılıklarını karşılaştırmak amaçlanmıştır. Bu amaca uygun olarak, insan ve doğa kaynaklarından ayrılan maya ve küf mantarları klasik mikoloji yöntemleri ile tanımlanmış ve NCCLS referans makrodilüsyon, mikrodilüsyon (M27-A, M38-P) ve agar difüzyon (E test) yöntemleri ile amfoterisin B, flukonazol, itrakonazol, ketokonazol, mikonazol, flusitozin, terbinafin karşısındaki duyarlılık durumları belirlenmiştir. Bulgularımıza göre, 263 insan ve 66 doğa kaynaklı olmak üzere toplam 329 örnek çalışılmış; bunlardan maya ve küf mantarları olmak üzere toplam 151 saf kültür elde edilmiştir. Maya grubundan 67 C.albicans, 36 C.albicans dışı Candida türlerinden ve 9 Candida dışındaki cinslere ait türlerden olmak üzere toplam 112 köken ayrılmış ve klasik mikoloji yöntemleri ile tanımlanmıştır. Küf grubundan da 24'ü Aspergillus, beşi diğer hiyalen hifomisetlerden ve 10'u dematiaceous mantarlardan olmak üzere toplam 39 köken kendi grupları içerisinde tarif edilmiş klasik mikoloji deneylerine başvurularak tanımlanmıştır. İnsandan ve doğadan ayrılan mantarların gerek ayırım gerekse yapı ve fizyoloji özelliklerinde önemli bir farkın bulunmadığı görülmüştür. Yöntemler karşılaştırıldığında C.albicans kökenlerinin antifungaller karşısındaki durumunu belirlemede denediğimiz makrodilüsyon, mikrodilüsyon ve E testi aynı antifungalleri aynı sırada göstermek suretiyle bu duyarlılıkları belirlemede yöntemler arasında bir fark olmadığı anlaşılmıştır. C.albicans'ın dirençli olduğu antifungallerin belirlenmesinde mikrodilüsyon ve E testi paralel sonuç vermiş (İTZ), makrodilüsyon bunlardan farklı olarak Amp B'yi ilk sırada göstermiştir. Birinci sıradaki düşük MIC değerinin saptanmasında da makrodilüsyon ve mikrodilüsyonların paralel sonuç verdiği gözlemlenmiştir. Yöntemlere göre karşılaştırıldığında C.albicans dışındaki Candida kökenlerimizin antifungaller karşısında duyarlı, doza bağımlı duyarlı olanlarını belirlemede denediğimiz makrodilüsyon, mikrodilüsyon ve E testi aynı antifungalleri aynı sırada göstermiş ve bu duyarlılıkları belirlemede yöntemler arasında önemli bir fark görülmemiştir. İlk sıradaki antifungale dirençli C.albicans dışı Candida kökenlerin belirlenmesinde makrodilüsyon ve mikrodilüsyon deneyleri paralel sonuç vermiş (AmpB), E testi bunlardan farklı antifungali (İTZ) ilk sırada göstermiştir. Düşük MIC değerinin saptanmasında makrodilüsyon ve mikrodilüsyon deneylerinin ilk ve ikinci sıradaki antifungali (KTZ ve MKZ) belirlemede paralel sonuç verdiği gözlemlenmiştir. Yüksek MIC değerinin saptanmasında ise mikrodilüsyon ve E testi ancak ilk sıradaki antifungali (KTZ) belirlemede paralellik göstermiştir. Candida dışı maya kökenlerinin makrodilüsyon, mikrodilüsyon ve E test yöntemleri ile düşük MIC değerinin saptanmasında ancak makrodilüsyon ve E test yöntemlerinin ilk sıradaki antifungali (KTZ) belirlemede paralel olarak aynı sonucu verdikleri görülmüş, mikrodilüsyon deneyi farklı sonuç vermiş, yüksek MIC değerini tespitte ise denediğimiz bu üç yöntem birbirinden farklı sonuç vermiştir. Aspergillus kökenlerinin makrodilüsyon, mikrodilüsyon yöntemleri ile ancak ilk sıradaki düşük MIC değerinin saptanmasında aynı antifungali (AmpB) gösterdikleri gözlemlenmiş, ikinci ve üçüncü sıradaki antifungaller ile yüksek MIC değeri gösteren antifungaller her iki yöntemde de farklı çıkmıştır. Aspergillus dışındaki diğer hiyalen küf kökenlerimizin makrodilüsyon, mikrodilüsyon yöntemleri ile ilk sıradaki düşük MIC değeri gösterdikleri antifungalin saptanmasında birbirine paralel olarak aynı antifungali (5-FC) gösterdikleri belirlenmiş, yüksek MIC değeri gösteren antifungalin tespitinde de aynı antifungalin (5-FC) ortaya çıktığı gözlemlenmiştir. Bu kökenlerin ikinci ve üçüncü sıradaki yüksek MIC değeri gösteren antifungalleri (KTZ, AmpB) yine her iki yöntemde de birbirine paralel ve aynı olmuştur. Denediğimiz dematiaceous küf kökenlerinin makrodilüsyon, mikrodilüsyon yöntemleri ile düşük MIC ve yüksek MIC değeri gösteren antifungalin saptanmasında makrodilüsyon ve mikrodilüsyon deneyleri farklı farklı antifungalleri farklı sırada ortaya çıkarmıştır. Tartışma Bölümünde, kökenlerimizin çeşitli antifungallere duyarlılıklarının değişik bakımlardan (I. Kökenlerin elde edildikleri kaynaklara bakılmaksızın, II. İnsan ve doğa kaynaklı oluşlarına göre, III. Sistemik mikozlu, genel hasta grubu ve kontrol grubuna ait oluşlarına göre) ayrıntılı biçimde tartışılmış ve genelleme yapılabilecek ortak noktalara bakılarak aşağıdaki sonuçlara ulaşılmıştır: Duyarlılık deneyleri sonucunda, C.albicans ve C.albicans dışı Candida kökenlerimizin, elde edildikleri kaynak (sistemik mikozlu, genel hasta grubu, kontrol grubu veya doğa) ne olursa olsun, her üç yöntemle de duyarlı bulundukları ilk sıradaki antifungal flusitozin olmuştur. Bu kökenler, insan ve doğa kaynaklı olmaları ve kullanılan yöntem ile ilgili bir farklılık göstermeksizin ikinci sırada flukonazole ve üçüncü sırada da itrakonazole duyarlı bulunmuşlardır. Bu iki grupdaki mantar kökenleri, kullanılan yönteme ve elde edildikleri hasta grubuna göre değişmek üzere amfoterisin B veya itrakonazole ilk sırada direnç göstermişlerdir. Candida dışı mayalarda ise kökenlerimizin düşük MIC ve yüksek MIC değerlerini gösterdikleri antifungaller belirlenmek istendiğinde kullanılan yönteme ve kökenlerin kaynağına göre ortaya çıkan farklılıkların bir genelleme yapmaya elverişli olmadıkları anlaşılmıştır. Küf kökenlerimizden; duyarlılık deneylerine aldığımız Aspergillus'ların düşük MIC değeri gösterdikleri ilk sıradaki antifungal, bu kökenlerin elde edildikleri kaynaklara bakılmaksızın ve insanlardan, doğadan ayrılan kökenler bir fark yaratmaksızın amp B olarak belirlenmiştir. İnsanlardan ve doğadan ayrılan Aspergillus kökenlerimizin yüksek MIC değeri gösterdikleri ilk sıradaki antifungal ise MKZ olarak belirlenmiştir. Aspergillus dışındaki hiyalen küf mantarlarımızın kaynakları ne olursa olsun gerek makrodilüsyon, gerekse mikrodilüsyon deneylerinde ilk sırada 5-FC'e düşük ve yüksek MIC değeri gösterdikleri gözlemlenmiştir. Dematiaceous küf mantarlarına ait kökenlerimizin düşük MIC ve yüksek MIC değeri gösterdikleri antifungalin tespitinde kullanılan yönteme ve kökenlerin kaynaklarına göre farklılıkların ortaya çıktığı, bir genellemeye gidilemediği görülmüştür. Bu bulgularımız, kendi içinde tartışılmış, ayrıca çeşitli yerli ve dış yayınların sonuçları ile de karşılaştırılmıştır. Ancak ilacın farmakokinetikleri, konağın bağışıklık yanıtı, altta yatan hastalık, infeksiyonun yeri ve ciddiyeti, etkenin virülensi ve mantar-konak-ilaç arasındaki etkileşim antifungal tedaviyi etkileyebilen faktörlerdir. Bu sebeple düşük bir MIC değeri her zaman tedavideki başarıyı belirtmeyecekse de in vitro direncin ekseri klinik yanıtsızlığın göstergesi olduğu kabul edilmektedir (Rex 97).

Fungi and fungal infections specially those due to the opportunistic organisms present in the nature have assumed a much greater importance because of their increasing incidence In recent years, fungal infections specially due to opportunistic fungi present in the environment are becoming more prominent and resistant strains to available antifungals imposed problems in therapy. These factors, has propelled interest in standardized, reproducible, reliable and clinically relevant in vitro susceptibility testing methods for antifungal susceptibility testing. To decrease the emergence of resistance it is recommended to identify the causative agents isolated from clinical specimens and to carry antifungal susceptibility tests in deep mycosis laboratories. In consideration of those important points, the present thesis aimed at comparing in vitro antifungal susceptibility of fungi isolated from systemic mycosis suspected patients, common patient groups and natural sources and from the healthy individuals as a control group. For this purpose, the yeast and mould fungi isolated from human and natural sources were identified using classical mycology methods and in vitro antifungal susceptibilities of the isolates were investigated against amphotericin B (Amp B), fluconazole (FKZ), itraconazole (ITZ), ketoconazole (KTZ), miconazole (MKZ), flucytosine (5-FC) and terbinafine (TBF) by NCCLS reference macrodilution, microdilution methods for yeasts and filamentous fungi (M27-A, M38-P) and agar diffusion (E test) methods. According to our findings, totally 329 samples were studied of which 263 were human and 66 from natural sources and 151 pure culture of yeasts and molds were obtained. From the yeast group 67 C.albicans, 36 non-albicans Candida species and 9 species other than Candida, totally 112 strains were isolated and identified using classical mycology methods. From the mold group 24 Aspergillus, 5 other hyalen hyphomycets and 10 dematieaceous fungi were isolated and a sum of 39 strains were identified using classical mycology tests which are defined in their own groups. There were no noticeable morphological and physiologycal differences among species isolated from human and natural sources. Comparison of antifungal susceptibilities of C.albicans strains by three methods resulted the same antifungals in the same rank, in this case there was no any difference among macrodilution, microdilution and E test methods. Microdilution and E test methods gave paralel results in defining the antifungals to which the tested C.albicans strains were resistant (İTZ) while macrodilution method demonstrated Amp B in the same rank. In defining the low MIC value macrodilution and microdilution methods gave paralel results with each other. When compared with regard to the methods, non-albicans Candida strains were in the same rank in macrodilution, microdilution and E tests methods in determining susceptibility and dose-dependence and no significant difference were seen among the methods in determining such susceptibilities. The macrodilution and microdilution tests revealed a parallel result (AmpB) in determining the rank order of antifungal resistance for non C.albicans Candida strains; however, the E test has shown another antifungal agent (ITZ) in the first level. In estimating the low MIC values, macrodilution and microdilution tests revealed parallel results in determining first and second ranking antifungal (KTZ and MKZ). In the case of finding out the high MIC values, microdilution and E test only coincided in determining the first ranking antifungal (KTZ). In determining the low MIC value of the non-Candida yeast strains by macrodilution, microdilution and E test methods, only the macrodilution and E-test methods revealed parallel results in defining the first ranking antifungal (KTZ), while microdilution test gave a different result. These three methods yielded in different results in determining the high MIC value for non-Candida yeast strains. Macrodilution and microdilution test results for Aspergillus strains isolated from human and natural sources only gave the same antifungal (AmpB) in determining the first ranking low MIC value and the second and third ranking antifungals giving high MIC value differed in both two methods. The hyaline mold strains other than Aspergillus has demonstrated the same antifungal agent (5-FC) in the first ranking low MIC value with macrodilution and microdilution methods. In determining the antifungal giving high MIC values, they have also shown the same antifungal (5-FC) in parallel to each other. The second and third ranking high MIC giving antifungal of those strains (KTZ, AmpB) have been parallel to each other again in both two methods. In determining the low MIC and high MIC value of the dematiaceous mold strains by macrodilution and microdilution techniques, the results of these two methods gave the different antifungals in a different rank. In the Discussion, the susceptibilities of our strains to tested antifungals were handled in details and from different points of view (I. Without regarding the origins of the strains isolated, II. According to their belonging to human or natural sources, III. According to the belonging to systemic mycosis, common patient groups and control group). The following results have been obtained in consideration of the common points which would help to make a generalization. According to the results of our susceptibility tests, whatever the origin was C. albicans and non-C.albicans Candida strains obtained (from systemic mycosis, common patient groups and control group or natural sources), the first antifungal that they have been found susceptible was flucytosine by all three test methods. These strains, irrespective of their being human or nature originated or any difference related to the method utilized, have been found susceptible to fluconazole, in the second rank and itraconazole in the third. The yeast strains in these two groups were susceptible to amphotericin B or itraconazole in the first rank, depending on the method used or the patient group providing them. As for the non-Candida yeasts, when determining the antifungals to which our strains reveal low and high MIC values, the differences occurred depending on the method used or on the strains origin. Therefore, it has been found out that the results were not suitable for a generalization and could not be ranked. Macrodilution and microdilution test results for Aspergillus strains isolated from human and natural sources only gave the same antifungal (AmpB) in determining the first ranking low MIC value without regarding their origins and without differing among them. The first ranking antifungal for Aspergillus strains isolated from human or natural sources for which they gave high MIC value was MKZ. The hyaline molds other than Aspergillus, not depending on the source, has shown the low and high MIC values at 5-FC at first level both in macrodilution and microdilution tests. Dematiaceous mold strains revealed different results depending on the methods used in determining the antifungal at which they have shown low and high MIC value and on the origin of the isolates. In this case, making a generalization was found impossible. All those results have been discussed in themselves and compared with various local and foreign publications in this field. which might indicate clinical response of fungal isolates. Concommitant with these problems, several new antifungal drugs Because of these factors, there is now a greater demand for standardized, reproducible, reliable and clinically relevant in vitro susceptibility testing of fungal isolates.
Keywords: BİYOLOJİ; Mantar