Kollajenaz perfüzyonu ile izole edilmiş primer hepatositlerde farklı koşullarda gen ekspresyonunun incelenmesi - Adıgüzel, Zelal (My University, 2004)
KOLLAJENAZ PERFÜZYONU İLE İZOLE EDİLMİŞ PRİMER HEPATOSİTLERDE FARKLI KOŞULLARDA GEN EKSPRESYONUNUN İNCELENMESİ Adı ve Soyadı: Zelal Adıgüzel Danışman adları: Prof. Dr. Beyazıt Çırakoğlu Doç. Dr. Kemal Baysal Program: Yüksek Lisans Tıbbi Biyoloji ve Genetik

Kronik karaciğer hastalığına yol açan hepatit gibi hastalıkların yaygınlaşması nedeniyle organ naklinin önemli ve vericilerin az olduğu karaciğer gibi bir organda, az sayıda sağlam karaciğer hücresinden hücre kültür teknikleriyle işlevsel bir organ oluşturulması tıp alanında üzerinde uğraşılan bir hedeftir. Bu amaca ulaşmada çalışmalar, hücre biyolojisi, moleküler biyoloji, kimya ve biyomühendislik alanlarının bir ara kesiti olan doku mühendisliği alanında yapılmaktadır ve ilerlemeler son yıllarda büyük hız kazanmıştır. Bu amaçla ve aynı zamanda karaciğer hücrelerine özgü işlevlerin ve gen ekspresyonu mekanizmalarının araştırılmasında kullanmak üzere hepatositler izole edilmekte ve primer hücre kültürleri yapılmaktadır. Hepatositler, üre ve albumin sentezi, ksenobiyotik mekanizması, bilurubin konjugasyonu gibi işlevlerden oluşan bir fenotip gösterir. Ancak kültür süresince izole hücreler, hepatositleri karakterize eden proteinlerin ekspresyonlarının değişmesi sonucunda dediferansiye olmakta ve fenotiplerini kaybetmektedirler. Hepatositlerin fenotiplerini kültür ortamında sürdürebilmeleri sağlamak için yoğun deneysel çalışmalar yapılmaktadır. Hepatositlerin fenotipini etkileyen faktörler; ekstraselüler matrikste yer alan bileşenler, kültür şekli, medyum içeriği, kültürde başka hücrelerin varlığı ve suda çözünür protein faktörlerdir. Bu tezde öncelikle Sprague-Dawley tipi sıçan karaciğerinden primer hepatositlerin izolasyonu için iki adımlı perfüzyon yöntemi optimize edilmiştir. Literatürde belirtilen sayılara benzer olarak 14-21 gün sürecek deneylerde yeterli protein ve RNA eldesini sağlayacak sayıda %90'ın üzerinde canlı, 100-200 X 106 hücre elde edilmiştir. Çalışmalar, hepatositlerin bir ekstraselüler matriks bileşeni olan kollajenle etkileşiminin, karaciğer dokusunda hepatosit fenotipini ve karaciğer spesifik gen ekspresyonunu etkilediğini göstermiştir. Bu tezde ekstraselüler matriksin karaciğer spesifik gen ekspresyonu üzerindeki etkilerini anlamak amacıyla hepatositler iki adımlı kollajenaz perfüzyonu yöntemiyle izole edilerek, 14 gün boyunca tek tabaka ve sandviç olarak kültüre edilmiş ve karaciğer spesifik gen ekspresyonu RNA ve protein düzeyinde ölçülmüştür. Bu amaçla, bu hücrelerden belli günlerde total RNA izole edilmiş, bu RNA'lardan cDNA sentezlenmiş ve karaciğere özgü bir protein olan albumin ve farklı koşullarda ekspresyonu değişmeyen (housekeeping) bir gen olan gliseraldehit 3 fosfat dehidrogenaz geninin ekspresyonu, semikantitatif RT-PZR yöntemi ile incelenmiştir. Tek tabakalı kültürlerde olduğu gibi, sandviç kültürlerde de bu süre zarfında albumin ekspresyonu gözlemlenmiştir, ancak her iki kültür sisteminde de ekspresyon azalmıştır. Farklılaşmış bir karaciğer proteini olan CK 18 sentezindeki değişiklikleri çalışmak amacıyla, hücreler lize edilerek bu lizatlardaki protein miktarı ölçülmüştür. Eşit miktarda protein lizatları SDS-PAGE jele yüklenerek PVDF membrana transfer edilmişlerdir. Bu membranlar kullanılarak immün blotlama yapılıp, CK18 ekspresyonlarının değişip değişmediği kemilüminesans yöntemi ile incelenecektir. Bu proteinin kollajen tek tabaka ve sandviç kültürlerde ekspresyon değişimlerinin ölçüm ve karşılaştırma çalışmaları sürdürülecektir. Bundan sonraki çalışmalar olarak, benzer deneyler laminin, matrigel gibi matrikslerle tekrarlanacaktır. Son olarak laboratuarımızda yürütülen projenin ana amacı olan yapay doku oluşumuna yönelik biyobozunur biyopolimerler ile hepatositlerin etkileşimleri gen ve protein ekspresyonu düzeyinde karakterize edilecektir. ISOLATION OF PRIMARY HEPATOCYTES BY COLLAGENASE PERFUSION AND ANALYSIS OF GENE EXPRESSION UNDER DIFFERENT CONDITIONS 2. SUMMARY As a consequence of prevalence of chronic liver disease causing viruses such as hepatitis, importance of liver transplants and donor shortage, obtaining organ function from minimal amounts of healthy liver cells using cell culture techniques has preoccupied the medical field. Efforts directed towards attaining this goal have been mainly in the field of tissue engineering, an intersection of cell biology, molecular biology, chemistry and bioengineering and progess has been accelerating in recent years. To attain this goal, as well as to investigate liver cells specific functions and gene expression mechanisms, hepatocytes have been isolated and primary cell cultures have been maintained. Hepatocyte phenotype includes urea and albumin synthesis, xenobiotic metabolism and bilirubin conjugation. However while in culture, isolated cells de-differentiate and lose their phenotypes as a result of changes in expression of hepatocyte characterizing proteins. In order to maintain the hepatocyte phenotype in culture, great variety of experimental studies have been performed. Factors that affect the hepatocyte phenotype are extracellular matrix components, culture configuration, media formulation, presence of other cell types in culture and soluble protein factors. İnitially a two-step perfusion method was optimized for isolation of primary hepatocytes from Sprague-Dawley rat liver. Consistent with numbers reported in the literature, 100-200 X 106, 90 % viable cells were obtained and sustained for 14-21 days, providing a sufficient yield for protein and RNA isolation. It has been reported that, the interaction of hepatocytes with collagen, an extracellular matrix component, influences the hepatocyte phenotype and liver specific gene expression in liver tissue. In this thesis, in order to understand the effect of extracellular matrix on liver specific gene expression, hepatocytes were isolated by two-step collagenase perfusion method, cultured for 14 days using monolayer and sandwich culture systems and liver specific gene expression was measured as a function of message and protein. To this end, total RNA was isolated from cells on the days specified, cDNA was synthesized from this RNA, and expression of albumin, a liver specific protein, and GAPDH, a housekeeping gene was analyzed using semi-quantitative RT-PCR. Albumin expression was detected in the monolayer cultures as well as in the sandwich cultures however, in both culture systems expression decreased gadually. In order to study changes in differentiated liver cell specific protein, CK18 synthesis, cells were lysed and the amount of protein in these lysates was measured. Equal amounts of cell lysates were resolved by SDS-PAGE followed by transfer onto PVDF membranes. Using these membranes, changes in CK18 expression will be analyzed by immuno-blotting and detected by chemiluminescence method. Variations in this protein's expression in monolayer and sandwich cultures will be measured and compared. Subsequent to these studies, experiments will be repeated using laminin and matrigel as extracellular matrix. Finally, to realize the main aim of the ongoing project in our laboratory towards formation of artificial tissue, the interaction of biodegadable polymers with hepatocytes will be characterized as a function of protein and gene expression.
Keywords: hücre biyolojisi (sitoloji) doku biyolojisi (histoloji); İnsan anatomisi; Teknoloji (Uygulamalı bilimler); Tıbbi Biyoloji ve Genetik; Tıp bilimleri