K vitaminine bağımlı kan pıhtılaşma faktörlerinin HPLC ile ayrımı - Otamış, Tülin (My University, 2001)
1. ÖZET K vitaminine bağımlı kan pıhtılaşma faktörleri olan protrombin (faktör II), faktör VII, faktör IX, faktör X, protein C ve protein S karaciğerde sentezlenir. Karaciğer kan koagülasyonu ve hemostaz mekanizmasında önemli bir merkezdir. Bu pıhtılaşma faktörlerinin herbirinin plazmadaki miktarları çeşitli karaciğer hastalıklarında büyük önem taşır. Ancak hasta plazmasında bu proteinlerin herbirinin ayrı ayrı ölçümü çok zaman alıcı ve pahalıdır. Bu sebeple kısa sürede bu proteinlerin hepsini birden ölçen bir metod klinik kullanımda çok yararlı olacaktır. Bu çalışmada, normal insan plazma havuzundan K vitaminine bağımlı proteinlerin izolasyonu ve bunların HPLC ile ayrımı gerçekleştirildi. Normal insan plazma (sitratlı) havuzundan K vitaminine bağımlı proteinlerin bir karışımı olan protrombin kompleksi baryum-sitrat adsorbsiyonu ve amonyum sülfat presipitasyonu yöntemleri kullanılarak izole edildi. Bu protrombin kompleksi, 930 ml., 1280 ml. ve 240 ml.,' lik 3 ayrı plazma havuzundan elde edildi. HPLC kullanılarak ayrım yapıldığında idantifiye edilemeyen bir pik (% 33.9±3.34) sonrasında sırasıyla, faktör X (% 3.1±0.55), faktör II+faktör VII (% 43.8±1.62), protein C ( % 6.1±1.24), faktör IX (?)( % 1.2±0.05), idantifiye edilmemiş bir başka pik (% 0.8±0.29) ve protein S ( % 10.8±2.12 ) pikleri elüe edildi. Saf faktörlere plazma ile aynı koşullarda HPLC uygulandı ve protein pikleri belirlendi. Protrombin kompleksinde K vitaminine bağımlı proteinlerin varlığı Ouchterlony çift immundifüzyon yöntemi ile immunolojik olarak gösterildi. Bu metod kullanılarak başlangıç materyalinin hacmi çok azaltıldığında ise elde edilen protrombin kompleksinin kromatogramı makro metoda benzer ama biraz farklı bulundu. pool. 2.

ISOLATION OF VITAMIN K-DEPENDENT BLOOD CLOTTING FACTORS Prothrombin (factor II), factor VII, factor IX, factor X, protein C and protein S which are vitamin K-dependent blood clotting factors, synthesis in liver. Liver is an important center for the blood coagulation and haemeostatic mechanism. The amounts of each clotting factor in plasma plays important roles in several liver diseases. However, as the measurement of each of these proteins in patient plasma is money and time consuming process, a method developed to make these measurements at once will be very useful for the clinical practice. In this study, the isolation of vitamin K-dependent proteins from normal human plasma pool and separation of them by HPLC was performed. Using the methods, barium-citrate adsorption and ammonium sulfate precipitation, prothrombin complex as a mixture of vitamin K-dependent proteins was isolated from normal plasma (citrated) pool. The prothrombin complex was provided from three normal plasma pools (930 ml., 1280 ml., 240 ml.). As a result of the separation process by HPLC, after one unknown peak (33.9±3.34 %), faktör X (3.1±0.55 %), faktör II+faktör VII (43.8±1.62 %), protein C (6.1±1.24 %), faktör IX (?)(1.2±0.05 %) , (?) ( 0.8±0.29 %) ve protein S (10.8±2.12 %) peaks were observed. The identification of proteins at the obtained peaks was achieved by the application of HPLC analysis to the pure factors having the same conditions with the plasma. The existence of vitamin K-dependent proteins in prothrombin complex was proved by Ouchterlony double immunodiffusion method. When this method was used with low volume normal plasma, the chromatogram was found to be similar to the results obtained from the plasma1
Keywords: Kan; Vitaminler