İnsan SNX2 proteini ile influenza virüsü rna polimeraz enzimi arasındaki ilişkinin memeli hücrelerinde araştırılması

Abstract

İnfluenza A virüsleri sekiz adet tek iplikli negatif polarite gösteren RNAmolekülünden oluşan genoma sahiptirler. Geniş bir konak yelpazesine sahip olan buvirüslerde replilasyon ve transkripsiyon işlevleri; PB2, PB1 ve PA alt birimlerindenoluşan RNA polimeraz enzimi tarafından gerçekleştirilir. Viral RNA polimeraz enzimikonak hücrede viral patogenezi etkileyen önemli bir faktördür. Bu çalışmada, mayaikili-hibrit metodu kullanılarak viral PA proteini ile ilişkisi gösterilen insan sortingnexin 2 (SNX2) proteinin influenza A virüsü replikasyonuna etkilerinin belirlenmesiamaçlanmıştır. Çalışmada maya ikili-hibrit testlerinde Saccharomyces cerevisiaehücreleri kullanıldı. Memeli hücrelerinde PA ve SNX2 proteinleri arasındakietkileşimi saptamak için yapılan çalışmalarda HEK293 ve HeLa hücrelerindenyararlanıldı. Enfeksiyon deneylerinde influenza A/ WSN/ 33-H1N1 veA/ duck/ Pennsylvania-H5N2 virüs ırkları kullanıldı. Protein etkileşimlerininsaptanmasında, birlikte immünçöktürme ve immünfloresan teknikler uygulandı.Memeli hücrelerinde SNX2 ya da PA protein düzeylerinin geçici olarak arttırılması,bu proteinleri kodlayan plazmitlerin hücrelere transfeksiyonu ile sağlandı. HücrelerdeSNX2 transkript düzeyini düşürmek (knock down) için siRNA teknolojisindenyararlanıldı. SNX2 protein düzeyi değiştirilen hücrelerde virüs replikasyonunun seyriviral proteinlerin analizi ile saptandı. SNX2 proteinin viral RNA polimeraz enzimineetkileri minireplikon modelleri ile araştırıldı. İmmünçöktürme, immünfloresan boyama ve PL testleri HEK293 ve/ veyaHeLa hücrelerinde plazmit vektörler üzerinden kodlanan SNX2 ve PA proteinlerininetkileşim halinde olduğunu gösterdi. SNX2 proteinine bağlanmada PA proteinininözellikle amino-terminal bölgesinin (PAdC) önemli olduğu saptandı. İnsan SNX2proteinin influenza A virüsü replikasyonuna negatif yönde etki ettiği, bu etkinin kuştipi influenza A/ duck/ Pennsylvania-H5N2 virüslerinde çok daha belirgin olduğuortaya kondu. Bu veriler PA ve SNX proteinlerinin influenza A virüsü patogenezinietkileyen faktörler arasında olduğu sonucunu verdi.

Influenza A viruses have a genome consisting of eight single-stranded negativesense RNA molecules. Replication and transcription of these viruses having a widehost range are performed by the RNA polymerase enzyme, which composed of PB2,PB1 and PA subunits. The influenza RNA polymerase is one of the important factoraffecting the viral pathogenesis in host cell. In this study, it was aimed to determinethe effects of human sorting nexin 2 (SNX2) protein, which is shown to be associatedwith viral PA protein by yeast two-hybrid assay on influenza A virus replication. Yeast two-hybrid assays were carried out with Saccharomycescerevisiae. HEK293 and HeLa cells were used for revealing the interaction betweenPA and SNX2 proteins in mammalian cells. Influenza A/ WSN/ 33-H1N1 andA/ duck/ Pennsylvania-H5N2 virus strains were used to infect the cells.Immunoprecipitation and immunofluorescence techniques were applied for detectionof protein interactions. Transient increase of SNX2 and/ or PA protein levels in themammalian cells was achieved by transfection of the plasmid DNAs encoding theproteins. siRNA interference technology was applied for knock down of SNX2transcript in the cells. The course of virus replication in the cells, over-expressing ofSNX2 protein or down regulated with gene specific siRNA was determined by analysisof the viral proteins. Effects of SNX2 protein on viral RNA polymerase wereinvestigated with minireplicon models. Immunoprecipitation, immunofluorescence staining and PL assay showedthat the SNX2 and PA proteins encoded from plasmid DNAs have interaction inHEK293 and HeLa cells. The amino-terminal region of the viral PA protein (PAdC)was found to be particularly important for binding to human SNX2. The results showedthat human SNX2 protein had a negative regulatory effect on influenza A virusreplication and this effect was much more pronounced for avian influenza A/ DkPenviruses. It was concluded that PA and SNX proteins are important factors thatdetermine the pathogenesis of influenza A viruses in mammalian cells.