Farelerde nucleus pedunculopontinus Tegmenti’deki gabaerjik nöronların gelişimsel incelemesi

Abstract

Nucleus pedunculopontinus tegmenti (PPN), beyin sapında bulunan bir nukleus olup, uyku uyanıklık döngüsünde ve lokomosyonda görev almaktadır. PPN’in içerdiği kolinerjik ve glutamaterjik nöronlar üzerine çok sayıda çalışma olmasına karşın GABAerjik nöronlar üzerine azdır. GABAerjik nöronların incelenmesinde kullanılan, gamma-aminobütirik asit’in üretiminde ve salınımında görev alan glutamik asit dekarboksilaz enziminin farklı izoformları olan GAD65 ve GAD67’nin gösterdiği hücresel farklılığın fonksiyonel yansımaları ilgi konusudur. Bu nedenle GAD65 ve GAD67 knock-in farelerin PPN’sinde gelişimsel olarak sayısal ve yerleşimsel farklılıklarına bakılmıştır. Her iki knock-in modelinden 14-25 günleri arasında 4 farklı yaş grubundaki(n=3) farelere ait beyinler Oxford Üniversitesi Anatomik Nörofarmakoloji Biriminden temin edilip, immünohistokimyasal yöntemle boyanarak florasan mikroskobu altında incelenmiş ve sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Sonuçlar GraphPad Prism 5.0 programında analiz edilmiştir. GAD65-GFP 14, 17, 22 ve 25 günlük hayvanlar incelendiğinde 14 günden 17 güne artış, 17 günden 25 güne ise düşüş göstermiştir (p=0.0007). GAD67 farelerde ise 14.güne göre 15.günde anlamlı bir artış gözlenmiştir (p= 0.0087). 15.günden 21. güne (p= 0.3595) anlamsız ve 21.günden ve 25. güne anlamlı bir azalma (p=0.0001 ) gözlendi. Her iki grup karşılaştırıldığında, 14.günler arasında anlamlı bir farklılık gözlemlenmezken (p= 0.2971), 25.günde GAD67-GFP hayvanlarda boyanmanın daha fazla olduğu gözlenmiştir (p=0.0002). Yerleşimsel olarak ise GAD67-GFP hayvanlarda boyanan nöronlar rostral yoğunlukta, GAD65-GFP hayvanlarda ise kaudal yoğunlukta olduğu gözlenmiştir. Bu bulgular ışığında, GAD65 içeren nöronların kaudalde yoğun olduğu, GAD67 içerenlerinse nukleus içinde rostral yoğunluklu olmak üzere heterojen dağılım gösterdiği görülmüştür. Nöron sayısındaki anlamlı değişiklikler REM uykusunun değişiklik gösterdiği günlerle paraleldir. GABAerjik, GAD 65, GAD 67, GFP, Nucleus pedunculopontinus tegmenti.

DEVELOPMENTAL CHANGES AT GABAERGIC NEURON NUMBERS IN MICE PEDUNCULOPONTINE NUCLEUS Pedunculopontine nucleus, which is a brainstem nucleus, has an important role in sleep/ wake cycle and locomotion. There are very few studies related to the developmental changes of GABAergic neurons in PPN. GAD65 and GAD67 are separate isoforms of glutamic acid decarboxylase enzyme, which produce and release gamma-aminobutyric acid. They have been being used in researches related to the GABAergic neurons and suggested that they have functional distinctions based on their cellular differences. Therefore, in this study GAD65/ GAD67 Green Florescence Protein (GFP) knock-in mice were used to understand developmental changes of GABAergic cell numbers and localization in PPN. The brains between postnatal (PN) day 14 to day 25, including two distinct animal models (total of 24), were received from Oxford University Anatomical Neuropharmacology Unit. These specimens were stained using immunohistochemical methods, examined under fluorescence microscopy and the results were statictically evaluated with GraphPad Prism 5.0. GAD65-GFP knock in mice 14, 17, 22, 25 PN days were studied and the results showed an increase from the PN14 to PN17, while PN17 to PN25 showed a decrease (p=0,0007). In GAD67-GFP knock in mice there was a significant increase from PN14 to PN15 (p=0,0087), and decrease from PN15 to PN21 (p=0,3595), but the difference was not as significant as PN21 to PN25 days (p=0,0001). PN14 and PN25 days of GAD65 and GAD67 mice were compared. There was no significant difference between PN14 day animals (p=0,2971). GAD67 group in the PN25 day animals showed more stained neurons (p=0,0002). In GAD67-GFP animals, the stained neurons were rostrally located while GAD65 neurons were more caudally located in the nucleus. The results of this study showed the developmental differences of PPN GABAergic neurons in accordance with the previous researches. Key Words: GABAergic, GAD 65, GAD 67, GFP, Nucleus pedunculopontinus tegmenti