Understandıng the response of bacterıa to plant orıgın antımıcrobıal alkaloıd (-)-roemerıne usıng bıosystem engıneerıng tools

Abstract

Tez Başlığı: Bitki Kökenli Antimikrobiyal (-)-Roemerin Alkaloidine Karşı Bakteriyel Cevabın Biyosistem Mühendisliği Araçları Kullanılarak Anlaşılması Çoklu-ilaçlara direnç gösteren bakterilerin hızla artmasından ötürü antibiyotik direnciyle savaşmak gitgide güçleşmektedir. Bu savaşta, bakteriyel direnç mekanizmalarını zayıflatan yeni antibakteriyel arayışı, araştırmaları biyoaktif moleküller için alternatif bir kaynak olan bitkilere yöneltmiştir. Bu nedenle, bu çalışmada, bitki alkaloidi (-)-roemerine’nin E. coli TB1 hücreleri üzerindeki antibakteriyel mekanizması araştırılmıştır. (-)-Roemerine’in minimum inhibitor konsantrasyonu (MİK) 100 µg/ ml olarak bulunmuştur. Bu bulgu doğrultusunda, E. coli hücrelerindeki değişim, 1× MİK (-)-roemerine’e maruz bırakıldıktan bir saat sonra incelenmiştir. İlaç adayı ile muamelenin ardınan hücrelerin sadece % 33’ünün koloni oluşturduğu bulunmuştur. Ekspresyonu farklı olan proteinleri belirlemek için iki boyutlu jel elektroforezi ve kütle spektrometrisi kullanılmıştır. Daha sonra, Ludesi REDFIN yazılımı ile (BIO-RAD), kontrol ve (-)-roemerine uygulanmış örneklere ait jellerdeki protein spot hacimleri karşılaştırılmıştır. Ekspresyonu farklı olan proteinlerden 16 tanesinin (eşik değeri ≥ 1.8 kat) karbonhidrat taşınmasında, D-glukarat katabolik prosesinde, amino asit biyosentezinde, amino asit taşınmasında, amino asit metabolizmasında, protein biyosentezinde, bakteriosin taşınmasında, dış membran bileşiminde, hücre redoks homoestosizinde ve hücre adezyonunda rol aldığı bulunmuştur. Ayrıca, gerçek-zamanlı kantitatif PZR ile yapılan transkripsiyonel farklılıklarının analizi, (-)-roemerine’nin dış membranda, antibiyotik direnç mekanizmalarında ve karbonhidrat taşınmasında rol oynayan proteinleri kodlayan genleri etkilediğini göstermiştir. STRING 9.1 veritabanı kullanılarak çizilen fonksiyonel etkileşim ağı, etkilenen tüm ekspresyonu farklı proteinler arasında güçlü bir etkileşim olduğunu göstermiştir. Bu tez, bitkilerden elde edilecek alternatif ilaç adaylarının keşfi açısından önemli bir çalışmayı ortaya koymaktadır.treated samples. 16 of the differentially expressed proteins with a cut-off value ≥ 1.8 fold, were found to be involved in carbohydrate transport, D-glucarate catabolic process, amino acid biosynthesis, amino acid transport, amino acid metabolism, protein biosynthesis, bacteriosin transport, outer membrane formation, cell redox homeostosis and cell adhesion. Furthermore, analysis of transcriptional differences with real-time quantitative PCR revealed that the genes encoding proteins related to the outer membrane, antibiotic resistance mechanisms, and carbohydrate transport were affected with (-)-roemerine treatment. The construction of the functional interaction network of all differentially expressed proteins by the STRING 9.1 database showed a strong interaction between them. This thesis work presents a novel work in the discovery of alternative drug leads from plants.

Thesis Title: Understanding the Response of Bacteria to Plant Origin Antimicrobial Alkaloid (-)-Roemerine Using Biosystem Engineering Tools Fighting with antibiotic resistance is a challenging task due to the exponential increase in multi-drug resistant bacteria. In this fight, the search for novel antibacterials that impair bacterial resistance mechanism(s), has led researches towards plants as alternative sources of bioactive molecules. Hence, in the current study, the antibacterial mechanism of the plant alkaloid (-)-roemerine against E. coli TB1 cells was investigated. The minimum inhibitory concentration (MIC) of (-)-roemerine was found as 100 µg/ ml. Based on this finding, the changes in E. coli cells were investigated following one hour of exposure to 1×MIC (-)-roemerine. Only 33% of the cells were found to form colonies after this treatment. Two-dimensional gel electrophoresis followed by mass spectrometry were used to identify the differentially expressed proteins. Ludesi REDFIN software (BIO-RAD) was then used to compare the spot volumes from gels of control and (-)-roemerine treated samples. 16 of the differentially expressed proteins with a cut-off value ≥ 1.8 fold, were found to be involved in carbohydrate transport, D-glucarate catabolic process, amino acid biosynthesis, amino acid transport, amino acid metabolism, protein biosynthesis, bacteriosin transport, outer membrane formation, cell redox homeostosis and cell adhesion. Furthermore, analysis of transcriptional differences with real-time quantitative PCR revealed that the genes encoding proteins related to the outer membrane, antibiotic resistance mechanisms, and carbohydrate transport were affected with (-)-roemerine treatment. The construction of the functional interaction network of all differentially expressed proteins by the STRING 9.1 database showed a strong interaction between them. This thesis work presents a novel work in the discovery of alternative drug leads from plants.