DNA’nın aljinatla kuvvetlendirilmiş kitozan boncuklar içinde enkapsülasyon ve serbestleşme özelliklerinin incelenmesi

Abstract

DNA' nın Aljinatla Kuvvetlendirilmiş Kitozan Boncuklar İçinde Enkapsülasyon ve Serbestleşme Özelliklerinin İncelenmesi Viral olmayan gen taşıyıcı sistemler son yıllarda çok yaygın olarak araştırılmaktadır. Diğer taraftan kitozan bir taşıyıcı olarak ilgi çekmektedir. Bu çalışmada gen taşıyıcı olarak kitozan boncuklar, iki farklı DNA tipi, pMK3 plazmid DNA ve salmon testis DNA kullanılarak hazırlanmıştır. pMK3 plazmid DNA ile, iyonotropik jelleşme yöntemi uygulanarak 680-760 mm boyutunda, sürekli DNA serbestleştiren boncuk hazırlanmıştır. Aljinatla kuvvetlendirilmiş kitozan boncuklarda, DNA' nın hazırlama sırasında ve serbestleşme deneyleri süresince stabil kaldığı ve yapısal özelliklerini muhafaza ettiği görülmüştür. Denenen formulasyon faktörlerinden; DNA konsantrasyonu ve formunun boncuk özelliklerinde önemli olduğu saptanmıştır. Boncuk büyüklüğü, DNA miktarına bağlı olarak artmıştır. Doğrusal DNA ile yapılan çalışmada, DNA' nın boncukta tutulma oranı, her üç formu içeren plazmid DNA' ya kıyasla daha düşüktür. Diğer taraftan, plazmid DNA formu ve konsantrasyonu, boncuklardan serbestleşme üzerine etkili değildir. Benzer çalışmalar salmon testis DNA ile yürütülmüştür. Yine iyonotropik jelleşme yöntemi ile, 673 mm büyüklüğünde muntazam şekilli boncuklar elde edilmiştir. Ancak serbestleşme çaışmasında; DNA' nın boncuk içerisinde immobilize halde kaldığı, serbestleşmediği görülmüştür. Salmon testis DNA ile kitozan mikroküre hazırlanması incelenmiş ve 1.34 mm boyutunda kitozan mikroküreler hazırlanmıştır. Ancak bu tip yapıda da DNA' nın immobilize halde kaldığı saptanmıştır. Burada, DNA ve kitozan arasında kompleks oluşabilirliği düşünülerek, bu konu üzerine yoğunlaşılmıştır. Uyguladığımız yöntemlerde DNA' nın yapısının değişmediği görülmüştür. DNA' nın kitozanla oluşturduğu komplekste 1:0.3 oranının önemli olduğu, bunun üzerindeki oranlarda, DNA' nın tümüyle kitozana bağlandığı ve serbest DNA kalmadığı görülmüştür. Boncuklara ilişkin çalışmaların ikinci bölümünde plazmid DNA yüklü kitozan boncukların in vivo transfeksiyon özelliği incelenmiştir. Fare bacak kasına enjekte edilen örneklerde, 180 gün sonra çıplak DNA'ya kıyasla yaklaşık 2 kat yüksek gen ekspresyonu saptanmıştır. Sonuç olarak yapılan bu ön çalışmada, DNA tipine bağlı olarak farklı amaçlara yönelik sistem geliştirilebileceği, plazmid DNA' nın kitozanda enkapsülasyonu ile in vivo gen ekspresyonu elde edilebileceği, salmon testis DNA enkapsülasyonunda ise immobilize bir sisten oluşturulabileceği konusunda olumlu sonuçlar elde edilmiştir. Investigation of Encapsulation and Release Properties of DNA Encapsulated in Alginate Reinforced Chitosan Beads. Non-viral gene delivery vectors is currently a very important area of research. On the other hand, chitosan have received considerable attentions as a carrier. In this study, chitosan beads were succesfully prepared as a gene delivery carrier by using two different type of DNA, namely pMK3 plasmid DNA and salmon testis DNA. pMK3 -loaded chitosan beads were prepared by ionotropic gelation method and the 680-760 mm bead size were obtained. In alginate treated chitosan beads, DNA remained stable and DNA integrity did not changed during the encapsulation and release processes. The form and the concentration of the DNA is considerably important on bead properties. Bead size incerased as the DNA amount increase. In linear DNA loaded chitosan beads, loading capacity was lower than supercoiled DNA. On the other hand, form and concentration of DNA did not affect the release from beads. Salmon testis DNA was studied as well as pMK3 plasmid DNA. Spherical and good shaped chitosan beads with the 673 mm bead size were obtained by using ionotropic gelation method. In release studies, DNA did not release from beads and immobilized. Salmon testis DNA loaded chitosan microspheres were investigated and the 1.34 mm microsphere size were obtained. Salmon testis DNA was also immobilized in this structure. From this point of research, we focused on chitosan-DNA complexes. Integrity of the DNA did not change from experimental procedures. In chitosan-DNA complexes, the ratio of DNA:chitosan was important and there was no free DNA when this ratio above 1:0.3 and the DNA was completely bind to chitosan. In the second part of the study, in vivo transfection properties of plasmid DNA loaded chitosan beads were investigated. Chitosan beads were injected into the leg muscle of mice and two fold higher expression was obtained with the beads than the naked DNA. As a result, in this preliminary study, we obtained two different promising systems by using two different DNAs, first, by encapsulating the plasmid DNA we had a controlled release system which have in vivo transfection activity, and the second, by encapsulating salmon testis DNA, we obtained an immobilized system.