Obezitede ras ile ilişkili nükleer protein geni anlatımının adipogenez ile ilişkisinin araştırılması

Abstract

Amaç: Bu çalışmada Ras ile ilişkili nükleer protein (RAN)’in; farklı gelişim evrelerindeki adipositlere, farklı dozlarda uygulanacak olan oksidatif stres faktörlerine (stearik asit, linoleik asit, etanol ve hidrojen peroksit) karşı yanıt olarak gen anlatımının ne yönde değişim göstereceği ile birlikte hücrelerin proliferasyon yeteneklerine olan etkileri araştırıldı. Gereç ve yöntemler: Çalışmada RAN geninin obezitedeki rolünü belirlemek amacıyla fare kökenli 3T3-L1 fibroblast hücreleri, iCELLigence sistemi ile gerçek zamanlı olarak gözlemlenerek, preadiposit ve olgun adipositlere farklılaştırıldı. Bu hücreler farklı konsantrasyonlarda sitotoksik ajanlara maruz bırakıldı ve hücre proliferasyonları yine iCELLigence sistemi ile izlendi. Elde edilen hücrelerden haberci RNA izolasyonu, haberci RNA’dan tamamlayıcı DNA sentezi ve elde edilen genetik materyalde sitotoksik ajanlara yanıt olarak, RAN geninin ekspresyonundaki değişimler TaqMan gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu ile tespit edildi. Bulgular: Oksidatif stres ajanlarının uygulama süreleri, gerçek zamanlı hücre monitörizasyonu ile çeşitli konsantrasyonların uygulanması sonrası IC50 değeri elde edilerek saptandı. 24 saat hidrojen peroksit (H2O2) uygulaması sonucu IC50 değeri 807 μM olarak saptandı. 24 saat 1 mM H2O2 uygulaması 3T3-L1 adiposit hücrelerinde letal etkiye sahipken 50-250 μM konsantrasyon aralığındaki H2O2 uygulamalarının adiposit proliferasyonunun üzerine anlamlı bir etkisi olmadığı gözlendi. RAN gen anlatımı dört ve beş saat 600 μM H2O2 uygulaması sonrası artarken; stearik asit, etanol ve 24 saat H2O2 uygulaması sonrası azaldı. Linoleik asit uygulaması sonucunda ise RAN geni ekspresyonu tamamen susturuldu. Sonuç: 600 μM H2O2’ye dört saat maruz kalan adipositlerde RAN geni anlatımı kontrol hücrelere kıyasla iki kat artarken, aynı dozda beş saat muamelenin gen anlatımını altı kata yakın artırdığının gözlenmesi farklılaşmış adiposit hücrelerinde glikoz homeostazının bozulduğunu düşündürmektedir. Etanolün RAN geni ifadesini azaltmasının ise insülin direncinin artmasına katkıda bulunduğu düşüncesindeyiz.

Objectives: This study aims to investigate how the gene expression of Ras-related nuclear protein (RAN) will change as a response to the adipocytes in different stages of development, oxidative stress markers (stearic acid, linoleic acid, ethanol and hydrogen peroxide) to be applied in different dosages and also its effects on the proliferation ability of cells. Materials and methods: In our study, to determine the role of the RAN gene in obesity, we differentiated mouse-derived 3T3-L1 fibroblast cells into preadipocytes and mature adipocytes by observing with iCELLigence system in real-time. These cells were exposed to cytotoxic markers at different concentrations and cell proliferations were monitored with iCELLgence system. The messenger RNA isolation from the obtained cells, complementary DNA synthesis from messenger RNA and the changes of RAN gene expression in response to cytotoxic markers obtained from the genetic material were identified by TaqMan real-time polimerase chain reaction. Results: Implementation periods of oxidative stress markers were found to be IC50 value by using real-time cell monitoring, which was obtained by applying various concentrations. After 24 hours application of hydrogen peroxide (H2O2), IC50 value was found as 807 μM. While 24 hours application of 1 mM H2O2 had lethal effect on adipocytes 3T3-L1 cells, we did not observe any significant effect of H2O2 applications in the concentration range of 50-250 μM on proliferation of adipocytes. While RAN gene expression increased after four and five hours of exposure to 600 μM H2O2 application, it decreased after application of stearic acid, ethanol and 24 hours of H2O2. As a result of application of linoleic acid, RAN gene expression was completely silenced. Conclusion: The observation of RAN gene expression having increased twice in adipocytes that were exposed to 600 μM H2O2 for four hours compared to control cells while five hours of exposure to the same dosage to increase nearly six times suggests the deterioration of glucose homeostasis in differentiated adipocyte cells. We think the fact of ethanol decreasing RAN gene expression contributes to the increase of insulin resistance.