In vitro rejenerasyonu sağlanan kabak (cucurbita pepo L.) bitkilerinde genetik kararlılığın moleküler seviyede değerlendirilmesi

Abstract

Cucurbita pepo L., Cucurbitaceae familyasının ekonomik değeri yüksek olan bir türüdür ve geniş yapraklara, dikensi tüylerle kaplı bir gövdeye sahip tek yıllık bir bitkidir. Yabancı tozlanan bir bitki olduğundan tür içi genetik varyasyonlar oluşmakta ve başlangıç materyalinin genetik karakterizasyonunun korunmamasına yol açmaktadır. Klasik ıslah metotlarıyla yapılan seleksiyonlar uzun yıllar aldığından; çeşit ıslahı çalışmalarını hızlandıran, verim ve kalite açısından önemli avantajlar sağlayan doku kültürü yöntemleri geliştirilmiştir. Bu tez çalışmasında Trakya Tarımsal Araştırma Enstitüsü tarafından virüslere karşı dayanıklılık ve üretimdeki verimin arttırılması amacıyla geliştirilen üç farklı hibrit kabak genotipine (Seyden, 17-92, Radiant) ait tohumlar kullanılarak elde edilen fidelerden alınan, kotiledon nodu, nod ve sürgün ucu eksplantlarından gelişen bitkilerin in vitro rejenerasyonu sağlanmıştır. En yüksek sürgün rejenerasyon oranı %88 ile Seyden genotipine ait kotiledon nodu eksplantından, 1 mg/ L veya 2 mg/ L Benzil Amino Pürin (BAP) içeren Murashige ve Skoog (MS) besi ortamlarından elde edilmiştir. Rejenere sürgünler en iyi bitki büyüme düzenleyicisi içermeyen MS besi ortamında köklendirilmiştir. Mikroçoğaltımı sağlanan Cucurbita pepo bitkilerinin genetik kararlılıkları kromozom, flow sitometri ve SSR analizleriyle değerlendirilmiştir. Tüm genotiplerde, kontrol bitkileriyle rejenere bitkilerin ploidi seviyelerinin aynı olduğu kromozom ve flow sitometri analizleriyle saptanmış, 2n=40 kromozomlu diploid hücreler tespit edilmiştir. Flow sitometri analiziyle kabak bitkilerinin 2C DNA miktarının 1,17 pg olduğu da doğrulanmıştır. Kullanılan 30 SSR primeri ile gerçekleştirilen PZR analizi sonucunda çoğaltım ürünü veren 29 adet primer, lokus büyüklükleri 95-895 baz çifti arasında değişen toplam 42 monomorfik bant üretmiştir. Sonuçlar, ülkemizde tarımı da yapılan, virüslere dayanıklı hibrit kabak (Cucurbita pepo) genotiplerinde etkin bir mikroçoğaltım protokolünün geliştirilmesiyle genetik olarak kararlı çeşitlerin üretilip, yabancı tozlaşma nedeniyle karşılaşılan çeşit sorununun çözülmesine katkı sağlayabileceği için önem taşımaktadır. Ayrıca bu çalışmanın, C. pepo bitkilerinde in vitro kültür koşullarından dolayı meydana gelebilecek olan somaklonal varyasyonların genetik kararlılığa etkilerinin flow sitometri analiziyle değerlendirildiği ilk çalışma olması da tez çalışmasını özgün kılmaktadır.

Cucurbita pepo L. is a species with high economic value in the Cucurbitaceae family. It is an annual plant which has broad leaves and a stem covered with spiny. Because it is a foreign pollinated plant, genetic variations occur within the species and this prevents the preservation of the starting material’s genetic character. Due to the fact that selection with conventional breeding methods takes many years, tissue culture methods have been developed that accelerate the breeding studies and provide significant advantages in terms of yield and quality. In this thesis project, three different hybrid cucurbit varieties (Seyden, 17-92, Radiant) were used which are developed by Thrace Agricultural Research Institute in order to provide resistance to viruses and increase the yield in production. Cotyledon node, node and shoot tip explants from sterile plants produced in vitro were developed and in vitro regeneration of the plants was achieved. The highest shoot regeneration rate was obtained from cotyledon node explant of Seyden variety with 88%, in the Murashige and Skoog (MS) medium containing 1 mg/ L or 2 mg/ L Benzyl Amino Purine (BAP). Regenerated shoots were best rooted in MS medium without plant growth regulator. Genetic stability of regenerated Cucurbita pepo plants was evaluated by chromosome, flow cytometry and SSR analysis. Chromosome and flow cytometry analysis were carried out for all the genotypes and there was no difference between ploidy levels of control plants and regenerated plants and diploid cells with 2n=40 chromosomes were detected for all samples. The flow cytometry analysis also confirmed that the amount of 2C DNA of squash plants was 1,17 pg. 29 markers selected out of 30 SSR markers according to their reproducibility produced 42 alleles with the size of bands ranged between 95-895 base pair. The results can contribute to obviatethe diversity encountered due to foreign pollination by developing an effective micropropagation protocol in the virus-resistant hybrid cucurbit (Cucurbita pepo) varieties cultivated in our country. In addition, this study is thought to be the first study in C. pepo plants to evaluate the effects of somaclonal variations on genetic stability that may occur due to in vitro culture conditions via flow cytometry analysis.