Düşük dansiteli lipoprotein (LDL) ve okside düşük dansiteli lipoprotein’in (o-LDL) nitrik oksit (NO) aracılı trombosit aktivasyonuna etkilerinin incelenmesi

Abstract

DÜŞÜK DANSİTELİ LİPOPROTEİN (LDL) VE OKSİDE DÜŞÜK DANSİTELİ LİPOPROTEİN’İN (o-LDL) NİTRİK OKSİT (NO) ARACILI TROMBOSİT AKTİVASYONUNA ETKİLERİNİN İNCELENMESİ Trombositler ve lipoproteinler ateroskleroz ve koroner kalp hastalıklarının patogenezinde önemli rol oynarlar. Bu çalışmada insan plazmasından izole edilen LDL ve LDL’nin oksidasyonu ile elde edilen okside LDL’nin (o-LDL) trombosit aktivasyonu üzerine olan etkilerinin trombosit L-arjinin ve NO yoluyla ilişkisinin aydınlatılması amaçlanmıştır. Kesikli dansite gradient ultrasantrifügasyon yöntemi kullanılarak LDL ve HDL fraksiyonları insan plazmasından saflaştırılarak elde edildi. LDL ve HDL’nin saflıkları trigliserit , total kolesterol , apoprotein düzeyleri ve lipoprotein jel elektroforezi ile belirlendi. Elde edilen LDL’nin bir kısmı Cu++ ile okside edilerek o-LDL elde edildi. o-LDL’nin lipid peroksidasyon düzeyi malondialdehid tayini ile belirlendi. Bu çalışmada sağlıklı 7 kişiden alınan kan örneklerinden izole edilen yıkanmış trombositler öncelikle L-arjinin (1mM) ve L-nitroarjinin metil ester (L-NAME, 1 mM) ile inkübe edilerek Nitrik oksid metabolitlerinin (NOx) düzeyi saptandı. Daha sonra Adenozin difosfat (ADP) indüklü trombositler ortamda L-arjinin varken veya yokken LDL (100 µg/ ml) , HDL (100 µg/ ml) ve o-LDL (100 µg/ ml) ile ayrı ayrı inkübe edildi. İnkübasyon sonrası trombosit P-selektin ekspresyonları flov sitometrik olarak ölçüldü. Sonuçlar her bir trombosit başına spesifik antikor bağlama kapasitelerine çevrildi. L-arjinin ilavesi trombosit NO düzeylerini kontrol grubuna göre anlamlı olarak artırmıştır (p<0.001). L-NAME ile inkübe edilen trombositlerin NO düzeyleri L-arjinin ile inkübe edilenlerden anlamlı olarak düşüktür (p<0.001). LDL ve o-LDL trombosit başına düşen P-selektin düzeylerini anlamlı olarak artırdı (p<0.001). Buna karşılık trombositlere LDL ve o-LDL ile inkübasyon öncesi L-arjinin ilavesi P selektin reseptörü sayılarının sadece LDL ve o-LDL ilavesine göre anlamlı olarak azalmasına neden oldu (p<0.01, p<0.001). Trombositlere o- LDL, L-arjinin ile birlikte HDL ilavesi ise trombosit P selektin reseptör sayısının azalmasına neden oldu ( p<0.001 ). HDL ile birlikte L-arjinin ilavesi P-selektin sayıları daha da düşük bulundu. Sonuç olarak in vitro olarak önceden eksojen L-arjinin ilavesi trombosit NO düzeylerini artışına neden olur, bu artış LDL’nin ve o-LDL’nin trombosit aktivasyonunu artırıcı etkisini azaltır. HDL’de L-arjininin bu etkisini kuvvetlendirir. LDL, o-LDL, HDL, Trombositler. Investigation of The Effects of Low Density Lipoprotein (LDL) and Oxidized Low Density Lipoprotein on Nitric Oxide (NO) Mediated Platelet Activation Platelets and lipoproteins play an important role in atherosclerosis and coronary heart diseases. The aim of this study was to investigate the relationship between L-arginine/ NO pathway and isolated lipoproteins from human plasma and oxidized LDL (ox-LDL). Human LDL and HDL were separated by density gradient ultracentrifugation and LDL was oxidized with Cu++ for 24 h at 37 °C. Purity of lipoproteins were assured by triglyceride, total cholesterol, apoprotein levels and lipoprotein gel electrophoresis. Lipid peroxidation levels of ox-LDL were performed with MDA assay. L-arginine (1 mM) and L-nitroarginine methylester (L-NAME, 1 mM) were treated with washed platelets and Nitric oxide metabolites (NOx) level was measured. Adenosine diphosphate (ADP) induced washed platelets were incubated with LDL (100 µg/ ml) , HDL (100 µg/ ml) and ox-LDL (100 µg/ ml) with or without L-arginine. After incubation, platelet P-selectin levels were measured by flow cytometry. The results were converted to specific antibody binding capacities per platelet. After treatment with L-arginine, platelet NO levels significantly increased compared to the controls (p<0.001). Platelet NO levels decreased with L-NAME compared to L-arginine (p<0.001). After incubation with LDL and ox-LDL, P selectin levels per platelet significantly increased (p<0.001). On the other hand, P selectin levels in platelets treated with L-arginine+LDL and L-arginine+ox-LDL decreased compared to the levels in platelets treated with only LDL and ox-LDL (p<0.01, p<0.001). Addition of HDL to L-arginine+ox-LDL caused sifnificant reduction in P selectin receptor numbers per platelet as in the control values (p<0.001). We conclude that pretreatment of platelets with exogenous L-arginine causes enhanced endogen platelet NO levels and negates the effects of LDL and ox-LDL on platelet activation and that HDL also strengthens this effect of L-arginine. Key Word: NO, LDL, o-LDL, HDL, Platelets.