Publication: Maternal dolaşımdaki fetal hücrelerin kullanılmasıyla PCR’ a dayalı noninvazif prenatal tanı yöntemlerinin geliştirilmesi
Abstract
Adı ve Soyadı: GÖZDE GÜVENÇ Danışman adı: PROF. DR. YAVUZ TAGA Program: YÜKSEK LİSANS YOKİMYA (TIP) ÖZET Herediter hastalıkların prenatal olarak kesin tanısının konulması fetal örneklerin toplanması esasına dayanmaktadır. Bu yöntemler invazif olan ve beraberinde bazı riskleri içeren yöntemlerdir. Bu nedenle invazif olmayan (girişimsel olmayan), anneye ve fetüse risk getirmeyen güvenilir ve etkin tanı yöntemlerine ihtiyaç vardır. Çalışmamızda maternal dolaşımdaki fetal hücrelerin kullanılmasıyla PCR'a dayalı noninvazif prenatal tanı yöntemleri geliştirildi. Bunun için fetal hücrelerin kullanılmasında kaynak olarak hem normal erişkin dolaşımda bulunmayan hem de maternal dolaşımda en fazla miktarda görülen fetal çekirdekli eritrositler (FNRBC) kullanıldı. Gebelikleri 8-20 hafta olan hamile kadınlardan toplanan kanlardan, FNRBC'ler öncelikle histopaque ile dansite gradyeni oluşturularak zenginleştirildi. Zenginleştirilen FNRBC'ler yüzeylerinde ekprese ettikleri transferin reseptörü yardımıyla ve değişik yaklaşımlar kullanılarak manyetik separatör ile izole edildiler. Elde edilen FNRBC'lerden fetüse ait olan DNA'lar izole edildi. Bu DNA'ların anneye mi fetüse mi ait olduğunu ispatlamak için erkek fetüslerde bulunan ve anneye ait olmayan Y kromozumuna ait diziler farklı primerler ve farklı yaklaşımlar kullanılarak PCR ile çoğaltılarak gösterildi. En etkili şekilde cinsiyet tansının konulması için nested PCR ve RT-PCR bir arada kullanıldı. Çalışmamızda genetik analiz incelemesi, özellikle iki hastalık üzerinde odaklandı, Trizomi 18 ve Trizomi 21(Down Sendromu). Trizomi 18'in pozitif DNA kontrolüne sahip olamamız nedeniyle bu kromozomal hastalık üzerinde ayırıcı bir tanı yapma şansına ulaşılamadı. Down sendromunda sağlayabildiğimiz pozitif kontroller sayesinde ve D21S11F, D21S11R primerlerini kullanarak ve farklı yaklaşımlarla hem konvansiyonel PCR hem de RT-PCR(real time PCR) ile Trizomi 21 prenatal tanı yöntemleri geliştirildi. Sonuç olarak çalışmamızda yeni yaklaşımlarla FNRBC'lerin izole edilmesi ve bu hücrelerden elde edilen fetal DNA örneklerinin genetik analiz yöntemlerinde kullanılabileceği ve girişimsel olmayan prenatal tanıda yararlı olacağı gösterilmiştir. DEVELOPMENT OF NONINVASIVE PRENATAL DIAGNOSTIC PROCEDURES BY USING FETAL CELLS IN THE MATERNAL CIRCULATION
Prenatal diagnosis depends on the correct collection of fetal specimens. However most of these procedures are invasive and possess certain risks. For this reason it is necasssary to develop noninvasive techniques which do not possess any risk for the fetus and the mother. In our study we developed noninvasive prenatal diagnosis methods using the fetal cells in the maternal circulation. For this approach as a source of the fetal cells fetal nucleated red blood cells (FNRBC) which are not present in the adult circulation and which are abundant in the maternal circulation have been chosen. FNRBCs were first enriched by a histopaque density gradient technique from the blood collected from pregnant women with a gestation of 8-20 weeks. The enriched FNRBCs are then isolated with the help of transferrin receptor that they express on the plasma membrane, by a magnetic separator. Fetal DNA was then obtained from these FNRBCs. In order to prove the heritage of these DNA to the fetus or the mother, certain primers specific to th Y chromosome were used for PCR procedures. The most successful approach in the discrimination of sex was the utilization of nested PCR and RT-PCR (real time PCR) together. In our trial we focused on two chromosomal defect diseases, Trisomy 18 and Trisomy 21 (Down Syndrome). Since we could not obtain positive control DNA for Trisomy 18 we were unable to devise differential diagnostic procedure. On the othe hand we obtained positive control DNA for Down Syndrome and using primers D21S11R and D21S11F, and with different approaches we were able to develop both conventional PCR and RT-PCR procedures successfully. As a conclusion our trial has shown that by using different and innovative approaches isolation of FNRBCs from maternal blood and the DNA obtained from these fetal cells is useful in the genetic analysis studies and noninvasive prenatal diagnosis.
Prenatal diagnosis depends on the correct collection of fetal specimens. However most of these procedures are invasive and possess certain risks. For this reason it is necasssary to develop noninvasive techniques which do not possess any risk for the fetus and the mother. In our study we developed noninvasive prenatal diagnosis methods using the fetal cells in the maternal circulation. For this approach as a source of the fetal cells fetal nucleated red blood cells (FNRBC) which are not present in the adult circulation and which are abundant in the maternal circulation have been chosen. FNRBCs were first enriched by a histopaque density gradient technique from the blood collected from pregnant women with a gestation of 8-20 weeks. The enriched FNRBCs are then isolated with the help of transferrin receptor that they express on the plasma membrane, by a magnetic separator. Fetal DNA was then obtained from these FNRBCs. In order to prove the heritage of these DNA to the fetus or the mother, certain primers specific to th Y chromosome were used for PCR procedures. The most successful approach in the discrimination of sex was the utilization of nested PCR and RT-PCR (real time PCR) together. In our trial we focused on two chromosomal defect diseases, Trisomy 18 and Trisomy 21 (Down Syndrome). Since we could not obtain positive control DNA for Trisomy 18 we were unable to devise differential diagnostic procedure. On the othe hand we obtained positive control DNA for Down Syndrome and using primers D21S11R and D21S11F, and with different approaches we were able to develop both conventional PCR and RT-PCR procedures successfully. As a conclusion our trial has shown that by using different and innovative approaches isolation of FNRBCs from maternal blood and the DNA obtained from these fetal cells is useful in the genetic analysis studies and noninvasive prenatal diagnosis.