G proteinleri üzerine yapı ve işlev çalışmaları

Abstract

Bu çalışmada merkezi sinir sisteminde yaygın olarak bulunan yapısı ve işlevi henüz açiklığa kavuşmamış olan Goα proteininin rekombinant olarak E.Coli’den saflaştırılması amaçlandı. Rekombinant Goα cDNA’sının, alıcı hücre olarak E.Coli Top10 hücreleri kullanılarak, pQE80 vektör sistemine alt klonlanması gerçekleştirildi. En uygun ekspresyon düzeyi farklı IPTG koşullarında ve farklı sıcaklıklarda belirlendi. 1 mM IPTG derişimimde 25oC’taki sıcaklıkta yüksek miktarda çözünür protein eldesinin mümkün olduğu saptandı. His etiketli Goα proteini Ni-NTA ilginlik kromotografisi kullanılarak saflaştırıldı. Saflaştırmanın her aşamasındaki protein miktarları Lowry yöntemiyle belirlendi. Elde edilen Goα proteinlerinin analizi SDS-PAGE ve Goα proteinine özgül antikor kullanarak Western emdirimi analizi ile gerçekleştirildi. Afinite kromotografisinden elde edilen proteindeki safsızlıklardan kurtulmak için, protein Sephadex G-100 (moleküler elek kromotografisi) kolonuna verildi. Böylelikle ikinci bir saflaştırma işlemi uygulanmış oldu. Protein etkinliğini belirlemek üzere floresans ölçümleri yapıldı. Proteinin içsel floresans spektrumları elde edildi. Proteinin guanin nükleotid bağlama etkinliği BODIPY FL-GTPγS probu kullanılarak gösterildi. Guanin nükleotid bağlama etkinliği ayrıca, GTP’nin hidrolizlenmeyen analoğu [35S]GTPγS kullanılarak belirlendi. Kullanılan pQE80 ekspresyon sistemiyle etkin Goα proteininin çözünür kesimden eldesi mümkün olmuştur.

This study was designed to overexpress and purify recombinant Goα protein, the most abundant type of G-protein in the nervous system. Goα protein was subcloned into the pQE80 vector system. Recombinant Goα was expressed in E.Coli Top10 cells that were transformed with pQE80 plasmid. Optimum expression levels were determined by using different IPTG concentrations and temperatures for induction. Soluble protein was obtained by overnight induction with 1mM IPTG at 25oC. His-tagged Goα protein was purified with Ni-NTA affinity chromatography. The protein was further purified by Sephadex G-100 gel filtration chromotography. The quantity of protein was detected by the Lowry method. The presence of Goα was monitored by SDS-PAGE and Western blot analysis by using monoclonal Goα antibody. Fluorescent measurement assays were performed in order to demonstrate the intrinsic fluorescence of Goα protein. The intirinsic florescence of protein was determined from its emission spectroscopy. The guanine nucleotide binding activity of Goα protein was demonstrated by using the BODIPY FL-GTPγS probe. The guanine nucleotide binding activity of Goα protein was also measured by [35S]GTPγS binding assay. In conclusion, we were able to purify active Goα protein by using the pQE80 expression vector system.