REV1 geninin DT40 hücrelerinde “Knock Out” edilerek somatik hipermutasyona etkisinin incelenmesi

Abstract

İmmünoglobulin (Ig) çeşitliliğine sebep olan başlıca 3 tane B lenfosit mekanizması vardır. Bunlar somatik hipermutasyon (SHM), Ig gen konversiyonu (GC) ve class switch rekombinasyonudur (CSR). Bu üç önemli mekanizmanın AID (Activation Induced Cytidine Deaminase) denilen bir protein ile kontrol edildiği yakın zamanda gösterilmiştir. Bu çalışmada, transversiyon mutasyonlarına sebep olduğu düşünülen REV1 geninin somatik hipermutasyonda görevi olup olmadığını anlamak için, DT40 hücrelerinde knock out edildi. Tavuk B lenfosit hücresi olan DT40 hücreleri; yüksek oranlarda hedef integrasyonu yaptığı için, genlerin diğer hücrelere göre daha kolay knock out edildiği, daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir. Öncelikle Rev1 geninin ekzonların yoğun olduğu bölge knock out için seçildi ve PCR yöntemi ile knock out vektörünün hedef kolları hazırlandı. Hedef kollar ve plazmiti hücrenin içerisinde ayırt edebilmek için ilaç direnç kasetleri, pBluescript plazmitine klonlandı ve daha sonra plazmitler linerize edilerek AID-/ -R?Vr-E IgM (+) hücrelere transfer edildi. REV1 geninin knock out edilip edilmediği hedef geni görüntüleme PCR reaksiyonu, FACS analizi ve dizi reaksiyonu ile kontrol edildi. Yapılan knock out sonucunda, bu hücrelerin normal DT40 hücrelerine göre çok yavaş büyüdüğü gözlendi. FACS analizleri, somatik hipermutasyonun AID-/ -R?Vr-E IgM (+) hücrelere göre yaklaşık 3 kat azaldığını gösterdi. Azalan mutasyonların hangi tür mutasyonlar olduğunu anlamak için DNA dizi analizi yapılarak, analizlerin sonucunda REV1 geninin sebep olduğu düşünülen CþG veya GþC transversiyon mutasyonlarının çok büyük oranda azaldığı gözlendi. Bu sonuçlar REV1 geninin, DT40 hücrelerindeki SHM'da en fazla görülen transversiyon mutasyonlarının, hemen hemen tamamını azaltarak bu mekanizmada önemli olduğunu gösterdi. There are three B cell specific processes; somatic hypermutation (SHM), immunoglobulin gene conversion (GC) and class switch recombination (CSR) which create the repertoire of antigen receptors. It has been recently showed that these three important mechanisms are controlled with Activation Cytidine Deaminase (AID) protein. In this thesis, we knocked out REV1 gene in DT40, a chicken B cell line, that is thought to be cause for transversion mutations in somatic hypermutation. In previous studies it has been showed that DT40 integrates transfected gene constructs at high ratios into the endogenous loci. This high frequency of targeted integration in DT40 is a powerful tool to test the function of candidate genes by gene disruption. The exon rich region of Rev1 was chosen on the gene and the target arms of knock-out construct were prepared by PCR. The target arms and drug resistance marker cassettes were cloned into the pBluescript plasmid. These plasmids were then linearized for transfection into the AID-/ -R?Vr-E IgM (+) cells. It was checked by targeting screening PCR, FACS analysis and sequence reaction if the REV1 gene was knocked out or not. After knocking out of REV1 gene, it was observed that these cells were growing slowly as compared to normal AID-/ -R?Vr-E IgM (+) cells. The FACS analysis showed that somatic hypermutation was approximately 3 times less than AID-/ -R?Vr-E IgM (+) cells. To understand which mutations became less in knocked out cells, the sequence reaction was made and the results of sequences showed that CþG or GþC transversion mutations that is thought to be caused by Rev1, decreased with high ratio. These results showed that REV1 gene is required for somatic hypermutation in chicken DT40 B cell line by decreasing transversion mutations with very high ratio.