Periferik kandan izole edilen hematopoietik kök İYİY hücrelerin megakaryosite farklılaştırılması

Abstract

Amaç: Yüksek doz kemoterapi veya hematopoietik kök hücre (HKH) transplantasyonu sonrası oluşan şiddetli trombositopeni çok ciddi klinik sorunlara yol açmaktadır. Son zamanlarda, trombositopeni ve benzer durumların tedavisi için ex vivo olarak farklılaştırılmış megakaryosit-progenitör hücrelerin (MPH) hastalara verilmesi üzerinde yoğun araştırmalar yapılmaktadır. Çeşitli kaynaklardan elde edilen HKH'lerin MPH ve megakaryositlere farklılaştırılmasıyla ilgili yeni tekniklerin geliştirilmesi temel ve klinik çalışmalar bakımından büyük bir önem taşımaktadır. Bu çalışmada, periferik kandan izole edilen HKH'lerin ex vivo iki aşamalı likit kültür yöntemiyle megakaryosite kadar farklılaştırılması amaçlanmıştır. Yöntem: Sağlıklı 3 donörden izole edilen mononüklear hücrelerden CD34+ HKH'ler elde edildi. Kök hücreler, önce 12 gün boyunca trombopoietin (TPO) (50 ng/ml), interlökin-3 (IL- 3) (20 ng/ml) ve interlökin 6 (IL-6) (20 ng/ml) içeren serumsuz medyumda, daha sonra 9 gün boyunca IL-6 (20 ng/ml) ve TPO (50 ng/ml) içeren serumsuz medyumda inkübe edildi. Megakaryositlerin farklılaşması, % CD34/41 oranlarına bakılarak akım sitometrik yöntemle izlendi. Hücrelerin morfolojik incelemeleri ise ışık, elektron ve floresans mikroskopla yapıldı. Bulgular: Morfolojik değerlendirmeler sonucunda kültürün 7. gününden itibaren megakaryositlerin oluşmaya başladığı; kültürün 21. gününde oluşan megakaryosit oranının ise >%70 olduğu saptandı. Sonuç: Elde edilen sonuçlar, uygulanan iki aşamalı hücre kültür yönteminin megakaryositleri yüksek oranda elde etmede etkin bir yöntem olabileceğini ortaya koymaktadır. Bununla birlikte, ümit vadeden bu metodun klinik uygulamalar açısından geliştirilmesi gerekmektedir.

Objective: Thrombocytopenia remains a serious problem in patients treated with highdose chemotherapy and bone marrow transplantation. In recent years, infusion of ex vivo expanded megakaryocytes (Mk) progenitors into patients has been proposed as a strategy for shortening the time of platelet engraftment. The development of in vitro culture methods to obtain sufficient numbers of Mks from haematopoietic stem cells (HSC) is an important target in basic and clinical research projects. The aim of this study was to develop a two-step ex vivo expansion culture system of Mk progenitors from peripheral blood stem cells (PBSC). Methods: PBSC were harvested from three healthy adult donors. CD34+ cells were isolated and cultured in serum free media supplemented with thrombopoietin (TPO) (50 ng/ml), Interleukin 3 (IL-3) (20 ng/ml) and Interleukin 6 (IL-6) (20 ng/ml) for 12 days followed by an incubation with IL-6 (20 ng/ml) and TPO (50 ng/ml) for another 9 days. The differentiation of Mks was monitored by flow cytometry (% of CD34+/41+ cells). The morphology of the cells was studied by light, electron and fluorescence microscopy. Results: Morphological analysis of cells generated after 7 days of culture showed typical aspects of developing Mks. The percentage of CD41+ cells was higher than 70 on day 21. Conclusion: The results obtained in this study demonstrated that this two-step culture system is an effective method to obtain high rates of megakaryocytes. It is obvious that this promising method needs further development for clinical applications.