Çocuklarda Febril Nötropeni atakları sırasında port katater varlığının tedavi başarısına etkisi

Abstract

Bir iyon çifti ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografisi metodu olan denatüran yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (DHPLC), polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış çift zincirli DNA dizilimlerindeki farklı bazlar yüzünden oluşan bağlanmamış bölgelerin meydana getirdiği heterodupleks yapıları temel alarak mutasyon ve polimorfizm taranmasında kullanılır. Yöntem ucuz, etkin, tekrarlanabilir ve kolay olması açısından son zamanlarda polimorfizm ve nokta mutasyonu tespiti için rutin bir laboratuvar uygulaması haline gelmeye başlamıştır. Çalışmada TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkezi, Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü'nde mevcut bulunan HPLC sistemi DHPLC analizine uygun hale getirilmiştir. Sistemin etkinliği ve güvenirliği, 248'inci ve 249'uncu amino asitlerini kodlayan kodonlarında bilinen nokta mutasyonları bulunan P53 geninin 300 nükleotidlik bölgesi kullanılarak yapılan deneylerle kanıtlanmıştır. pBluescript II SK(+) plazmidinin BamHI ve SpeI restriksiyon enzim kesim bölgeleri arasına klonlanmış olan, doğal ve 248'inci ve 249'uncu amino asitleri kodlayan kodonlarında nokta mutasyonu bulunan 300 nükleotid uzunluğundaki P53 gen formları özgül primerler kullanılarak çoğaltıldıktan sonra kaynatılarak denatüre edilmiş ve doğal ve mutant formlar karıştırılarak homo ve heterodupleks yapıların eldesi sağlanmıştır. The DHPLC Melt Program tarafından belirlenen 58°C'lik kısmi denatüran kolon sıcaklığında ve HaeIII restriksiyon enzimi ile kesilmiş pBR322 plazmidi kullanılarak yapılan kolon kalibrasyonu ile belirlenen dakikada 0.6 ml akış hızında yapılan DHPLC analizleri sonrasında elde edilen kromatogramlarda, sadece homoduplekslerin verdiği tek, yarılmamış ve ideal bir gausian pikinin yanı sıra gözlemlenen daha erken elüe olmuş ve yarılmış pik oluşumlarına dayanarak örneklerde heterodupleks yapıların tespiti yapılmıştır. Mevcut HPLC sistemlerinin yapılan küçük eklemelerle DHPLC analizi ile polimorfizm ve nokta mutasyonlarının taranmasında güvenilir, etkin ve kolay bir şekilde kullanılabileceği bu çalışma ile ispatlanmıştır.

Bir iyon çifti ters faz yüksek basınçlı sıvı kromatografisi metodu olan denatüran yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (DHPLC), polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılmış çift zincirli DNA dizilimlerindeki farklı bazlar yüzünden oluşan bağlanmamış bölgelerin meydana getirdiği heterodupleks yapıları temel alarak mutasyon ve polimorfizm taranmasında kullanılır. Yöntem ucuz, etkin, tekrarlanabilir ve kolay olması açısından son zamanlarda polimorfizm ve nokta mutasyonu tespiti için rutin bir laboratuvar uygulaması haline gelmeye başlamıştır. Çalışmada TÜBİTAK Marmara Araştırma Merkezi, Gen Mühendisliği ve Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü'nde mevcut bulunan HPLC sistemi DHPLC analizine uygun hale getirilmiştir. Sistemin etkinliği ve güvenirliği, 248'inci ve 249'uncu amino asitlerini kodlayan kodonlarında bilinen nokta mutasyonları bulunan P53 geninin 300 nükleotidlik bölgesi kullanılarak yapılan deneylerle kanıtlanmıştır. pBluescript II SK(+) plazmidinin BamHI ve SpeI restriksiyon enzim kesim bölgeleri arasına klonlanmış olan, doğal ve 248'inci ve 249'uncu amino asitleri kodlayan kodonlarında nokta mutasyonu bulunan 300 nükleotid uzunluğundaki P53 gen formları özgül primerler kullanılarak çoğaltıldıktan sonra kaynatılarak denatüre edilmiş ve doğal ve mutant formlar karıştırılarak homo ve heterodupleks yapıların eldesi sağlanmıştır. The DHPLC Melt Program tarafından belirlenen 58°C'lik kısmi denatüran kolon sıcaklığında ve HaeIII restriksiyon enzimi ile kesilmiş pBR322 plazmidi kullanılarak yapılan kolon kalibrasyonu ile belirlenen dakikada 0.6 ml akış hızında yapılan DHPLC analizleri sonrasında elde edilen kromatogramlarda, sadece homoduplekslerin verdiği tek, yarılmamış ve ideal bir gausian pikinin yanı sıra gözlemlenen daha erken elüe olmuş ve yarılmış pik oluşumlarına dayanarak örneklerde heterodupleks yapıların tespiti yapılmıştır. Mevcut HPLC sistemlerinin yapılan küçük eklemelerle DHPLC analizi ile polimorfizm ve nokta mutasyonlarının taranmasında güvenilir, etkin ve kolay bir şekilde kullanılabileceği bu çalışma ile ispatlanmıştır. DETECTION OF MUTATIONS CODING AMINO ACIDS 248 AND 249 OF P53 GENE USING DHPLC METHOD SUMMARY Denaturing high-pressure liquid chromatography (DHPLC) is an ion-pair reverse-phase high-pressure liquid chromatography method. DHPLC enables the detection of point mutations and polymorphism based on the heteroduplex formations due to non-paired bases on the PCR amplified DNA duplexes. As being a relatively cheap, effective, reproducible, DHPLC is becoming a routine laboratory technique. In this study, the HPLC system at TUBITAK, Marmara Research Center, Research Institute for Genetic Engineering and Biotechnology was modified to be used in DHPLC analysis. The usage of 300-nucleotide long P53 gene region containing known point mutations in codons 248 and 249 proved the efficiency and reproducibility of the system. The native and mutant forms of P53 gene region of 300 nucleotide long, cloned between BamHI and SpeI restriction enzyme sites of pBluescript II SK(+) plasmid, were amplified by using gene specific primers. After denaturation by heating, the native and mutant forms were mixed to form homo and heteroduplexes. Denaturing column temperature was determined as 58°C using the DHPLC Melt Program. The optimum flow rate of 0.6 ml/ min was determined by column calibration using pBR322/ HaeIII digest. The presence of heteroduplexes in the sample was detected as early eluted and multiple peaks as compared to a single, ideal gausian peak of homoduplexes in the chromatograms of DHPLC analysis under these conditions. This study proved that by a slight modification of HPLC systems at hand, it is possible to make DHPLC analysis to detect polymorphism and point mutations easily, efficiently and reproducibly.