Publication: Zebra balıklarında oluşturulan TİP 2 diyabet modelinde Stevia Rebaudiana’nınolası etkilerinin incelenmesi
Abstract
Zebra Balıklarında Oluşturulan Tip 2 Diyabet Modelinde Stevia rebaudiana’nın Olası Etkilerinin İncelenmesiÖğrencinin Adı: Esra DandinDanışman: Prof.Dr. Ebru Işık AlturfanAnabilim Dalı: Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı1.ÖZETAmaç: Çalışmamızdaki amaç, zebra balığında fazla beslenme ile oluşturulan tip 2 diyabet modelinde Stevia rebaudiana’nınolası etkisinin incelenmesidir. Gereç ve Yöntem: Yetişkin zebra balıkları 15 gün boyunca fazla beslenmeye ve Stevia rebaudiana’nın düşük ve yüksek olmak üzere iki dozuna maruz bırakılmıştır. Buna göre Kontrol (K), Diyabet (D), Diyabet+Düşük Doz Stevia (D+DDS) ve Diyabet+Yüksek Doz Stevia (D+YDS) şeklinde gruplar oluşturulmuştur.15 günsonunda zebra balıklarında oral glukoz tolerans testi uygulanmış ve karaciğer- pankreas dokuları çıkarılarak homojenize edilmiştir.Deney başında ve sonunda hayvanların açlık kan glukoz düzeyleri, deney sonunda oral glukoz tolerans testi yapılmıştır. Biyokimyasal parametreler spektrofotometrik yöntemle, gen ekspresyonları RT-PCR yöntemi ile ölçülmüştür. Bulgular:D grubunda deney süresi sonundavücut ağırlıkları ile açlık kan glukoz düzeyleri hem kendi başlangıç değerlerine hem de K grubu 15.gün değerlerine göre artmıştır. D grubunda lipit peroksidasyon (LPO), nitrik oksit (NO) düzeyleri artmıştır, süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon S-transferaz (GST) aktiviteleri ise azalmıştır. D grubunda leptin, fibroblast büyüme faktörü 21(fbf21), interlökin 21 (lL21) ile tümör nekroz faktörü alfanın (tnfα) gen ekspresyon düzeyleri artarkendnmt3a ekspresyon düzeyi azalmıştır. Sonuçlar: Stevia uygulaması D grubunda bozulan oksidan antioksidan dengeyi, gen ekspresyon düzeylerini ve kan glukoz düzeylerini düzeltmiştir. İÇİNDEKİLERBEYAN ........................................................................................................................iTEŞEKKÜR ...............................................................................................................iiİÇİNDEKİLER .........................................................................................................iiiKISALTMALAR VE SİMGELER..........................................................................viTABLO LİSTESİ .......................................................................................................xRESİM LİSTESİ .......................................................................................................xiŞEKİL LİSTESİ ......................................................................................................xii1- ÖZET ......................................................................................................................12- ABSTRACT ...........................................................................................................23- GİRİŞ VE AMAÇ .................................................................................................34- yabet Hastalığı………………………………………………………………...54.1.1. Diyabet hastalığının sınıflandırılması…………………………………….......74.1.1.1. Tip 1 diyabet………………………………………………………………...74.1.1.2. Tip 2 diyabet………………………………...………………………………84.1.1.3. Gestasyonel diyabet…………………………..……………………………104.1.1.4. Monogenik diyabet-gençlerde görülen T2DM (MODY, maturity diabetes onset of the young) …………………………………….………………………....…124.2. Diyabet Hastalığının Klinik Belirtileri…………….……………………………124.2.1. Diyabetin primer etkileri…………………………………………..…………124.2.1.1. Hipoglisemi………………………………………………………....………124.2.1.2. Diyabetik ketoasidoz……………………………………………….………134.2.1.3. Açlık hiperglisemisi…………………………………………………..……134.2.1.4. Hiperglisemik hiperosmolar durum………………………………….……144.2.1.5. Laktik asidoz………………………………………………………………144.2.2. Diyabetin sekonder etkileri……….....………………………………………144.2.2.1.Kardiyovasküler hastalıklar…………...........………………………………144.2.2.2. Nefropati……………………………………........…………………………154.2.2.3. Retinopati………………………………………….......……………………174.2.2.4. Nöropati……………………………………………….........………………184.2.2.5. Diyabetik ayak……………………………………………..…….…………184.2.2.6. Oral sağlık………………………………………………….....……………204.2.2.7. Hamilelikle ilişkili diyabetik komplikasyonlar……………………………204.3. Tip 2 Diyabet Gelişiminde Etkili Moleküler Mekanizmalar...............................214.4. Tip 2 Diyabet ve Obezite İlişkisi……………………………………………….234.4.1. Leptin…………………………………………………………………………254.5. Fibroblast Büyüme Faktörü 21 (FGF21)……………………………………….264.6. Diyabet Gelişimindeki Epigenetik Faktörler…………………………...............274.6.1. DNMT3A ……………………………………………………………….........284.7. Tip 2 Diyabet Gelişimde İnflamasyonun Rolü…………………........................314.7.1. İnterlökin-21…………………………………………………………….........324.7.2. Tümör nekroz faktörü alfa (Tnf-alfa, Tnf-α)…………………………….....324.8. Tip 2 Diyabette Oksidan-Antioksidan Durum …………………………………354.9. Tatlandırıcılar …………………………………………………………………..384.9.1. Stevia rebaudiana……………………………………………..........................414.10. Zebra Balıklarında Oluşturulan Diyabet Modelleri……………………...........434.10.1. Fazla beslenme ile oluşturulan tip 2 diyabet modeli……………………..455. GEREÇ ve YÖNTEM5.1. Zebra Balıkları Bakım ve Beslenme Prosedürü………………………………...485.2. Kullanılan Cihazlar……………………………………………………………..495.3. Kullanılan Kimyasallar…………………………………………………………495.4. Maruziyet Grupları……………………………………………………………...515.5. Maruziyet Uygulaması…………………………………………………….........515.6. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT)………………………….………………..525.7. Oksidan ve Antioksidan Parametrelerinin İncelenmesi………………………...545.7.1. Parametreler için tayin yöntemleri……………………………………….......545.7.1.1. Total protein tayini ………………………………........................................545.7.1.2. Lipit peroksidasyon (LPO) tayini ………….................................................565.7.1.3. Total nitrik oksid tayini…………...........................…………………...........575.7.1.4. SOD aktivitesi tayini ……………………………........................................595.7.1.5. GST aktivitesi tayini......................................................................................605.8. Gen İfadesi Analizi (RT-PCR)…………………………….................................625.8.1. Delta delta Ct metodu ile veri analizi ……………………………...................625.9. İstatistiksel Analizi……………………………...................................................636. BULGULAR6.1. Grupların 15.gün Vücut Ağırlıkları Karşılaştırması............................................646.2. Kan Glukoz Değerleri………………………………………………..…………656.2.1. Başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerleri………………….…….……..656.2.2. 15. gün açlık kan glukoz değerleri……………………………...................666.2.3. Grupların 0-15. gün açlık kan glukoz değerleri karşılaştırması……….….676.2.4. Grupların oral glukoz test sonuçlarının karşılaştırılması………….…........686.3. Oksidan-Antioksidan Sistem Parametreleri ……………………………...........696.3.1. Grupların lipit peroksidasyon (LPO) analizi sonuçları…………………….…696.3.2. Grupların süperoksit dismutaz (SOD) analizi sonuçları………………….…..706.3.3. Grupların glutatyon S-transferaz (GST) analizi sonuçları……………….…...716.3.4. Gruplarınnitrit oksit (NO) analizi sonuçları………………...........…….........726.4. RT-PCR Analizi Sonuçları……………………………………………….….....736.4.1. fgf21 mRNA ekspresyon analizi sonuçları……………………………...........736.4.2. dnmt3amRNA ekspresyon analizi sonuçları…………………………….........746.4.3. lepamRNA ifade analizi sonuçları……………………………........................756.4.4. IL21mRNA ifade analizi sonuçları…………………………….......................766.4.5. tnf αmRNA ifade analizi sonuçları…………………………….......................777. TARTIŞMA ve SONUÇ……………………………...........................................788. KAYNAKLAR…………………………….........................................................879.EKLEREK-1. Ulusalararası Kongre Bildiri Özeti…………………………….......................95EK-2. Etik Kurul Onayı……………………………..................................................9610. ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………97KISALTMALAR VE SİMGELER LİSTESİ(H2O2): Hidrojen peroksit(NO): Nitrik oksit(O2): Oksijen(O2.-): Superoksit anyone(OH.): Hidroksi radikali(ONOO-): Peroksinitritα: Alfa actb1: Beta aktinACR: Albumin/ Kreatinin oranıADA: Amerikan Diyabet Birliği ADP: Adenozin difosfatAsk1: Apoptoz sinyal düzenleyici kinaz 1ATP: Adenozin trifosfatATPaz: Adenozin trifosfatı, adenozin difosfat ve ortofosfata hidrolizleyen enzimβ: BetaCa2+: Kalsiyum iyonuCAT: KatalazCDC: Hastalık kontrol ve önleme merkezleriDKA: Diyabetik KetoasidozDM: Diabetes MellitusDMSO: Dimetil SülfoksitcDNA: Kopya DNA Ct: Eşik döngü sayısıCu-Zn-SOD: Cu/ Zn superoksit dismutazCyp2D: Sitokrom P450 2DD:DiyabetD+DDS: Diyabet + Düşük Doz SteviaD+YDS:Diyabet + Yüksek Doz SteviaDNA:Deoksiribo nükleik asitENU: N-Etil-N-NitrosüreFADH2: Flavin adenin dinükleotidFDA: Besin ve İlaç YönetimiFBG: Fazla beslenen grupFGF-21: Fibroblast büyüme faktörü 21γ: Gama GDM: Gestasyonel DiyabetGLUT: Glukoz TaşıyıcıGRAS: Genel olarak kullanımı güvenliGSH:GlutatyonGSH: L-GlutatyonGST: Glutatyon S-transferazHbA1c: Glikozile HemoglobinHCl: Hidroklorik asitHd: Periventriküler hipotalamus’un dorsal bölgesiHEPES: 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineethansulfonik asitHGMD: İnsan Gen Mutasyon VeritabanıIDF: International Diabetes FederationIFN-γ: İnterferon-γIRS: İnsülin reseptör substratıK: KontrolK+: Potasyum iyonuK2HPO4: Dipotasyum hidrojen fosfatKH2PO4: Potasyum dihidrojen fosfatKoQ10: Koenzim Q10LDL: Düşük yoğunluklu lipoproteinLNCS: Düşük ya da sıfır kalorili tatlandırıcıMDA: MalondialdehitmRNA: Mesajcı ribo nükleik asitNa2HPO4: Disodyum hidrojen fosfatNa+: Sodyum iyonuNaCl: Sodyum klorürNAD(P)H: Nikotinamid adenin dinukleotit fosfatNADH: Nikotinamit adenin dinükleotidNa-EDTA: Sodyum etilendiamin tetraasedik asitNaOH: Sodyum hidoksitNEDD: N-(1-Naftil)-etilendiamin dihidroklorürNOS: Nitrik oksit sentazNTR: NitroredüktazOECD: Ekonomik Kalkınma ve İşbirliği ÖrgütüOGTT: Oral glukoz tolerans testiPBS: Fosfat tampon tuzu tabletpH: Hidrojenin gücüROT: Reaktif oksijen türleriSer/ Thr: Serin/ ThreoninSOD: Superoksit dismutazSULF: SülfaniamidSVG: Steviol glukuronitTBA: Triklorasetik asitTCA: Tiyobarbürik asitTDD: Türkiye Diyabet Derneği TNF-α: Tümör nekroz faktör-αT1DM: Tip 1 diyabetT2DM: Tip 2 diyabetVCl3: Vanadyum (III) KlorürWHO: Dünya sağlık örgütüZnSO4: Çinko sülfatTABLOLAR LİSTESİTablo 1:Genel diyabet tanı kriterleri Tablo 2: Deneylerde kullanılan cihazlarTablo 3: Kullanılan kimyasallar listesiTablo 4: Total protein tayini yöntemiTablo 5: Lipit peroksidasyon tayin yöntemiTablo 6: Nitrik oksit tayin yöntemiTablo 7: Superoksit dismutaz tayin yöntemiTablo 8: GST tayin yöntemiRESİM LİSTESİResim 1: Stevia rebaudianaResim 2: ZEBTEC Mini Akvaryum sistemiResim3:Çalışmamızda gerçekleştirilen kan alımı uygulamasına ait görüntüResim4:Çalışmamızda mikropipet yardımıyla yapılan gavaj uygulamasına ait görüntüŞEKİLLER LİSTESİŞekil 1:DNA metiltransferazların (DNMT) replikasyonda (A) ve De Nova Metilasyonda İşlevleriŞekil 2: Steviol glikozitlerin iskeleti (A), Stevioside (B), Rebaudioside A (C)Şekil 3:Kan alımı yapılan dorsal aort damarının konumuŞekil 4:Grupların 15.gün vücut ağırlıkları karşılaştırması grafiğiŞekil 5:Grupların başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil 6:Grupların başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil7:Grupların başlangıç (0.gün) ve 15. gün açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil 8:Grupların başlangıç oral glukoz tolerans test sonuçları grafiği (15.gün) Şekil 9: Grupların lipit peroksidasyon değerlerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 10: Grupların süperoksit dismutaz aktivitelerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 11: Grupların glutatyon S-transferaz aktivitelerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 12: Grupların nitrik oksit değerlerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 13:Grupların fgf21mRNA ekspresyon analizi grafiğiŞekil 14:Grupların dnmt3amRNA ekspresyon analizigrafiğiŞekil 15: Grupların lepamRNA ekspresyon analizigrafiğiŞekil 16: K ve maruziyet gruplarının IL21mRNA ifade analizi grafiğiŞekil 17: K ve maruziyet gruplarının tnfαmRNA ifade analizi grafiğİ
Investigation of the Possible Effects of Stevia rebaudiana on Type 2 Diabetes Model in ZebrafishName of the Student: Esra DandinAdviser: Prof.Dr. Ebru Işık AlturfanDepartment:Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy2.ABSTRACTObjective: The aim of this study was to investigate the possible effects of Stevia rebaudiana in a model of type 2 diabetes mellitus induced by overnutrition in zebrafish.Materials and Methods: Adult zebrafish were exposed to overfeeding and low and high doses ofStevia rebaudianafor 15 days. Accordingly, Control (K), Diabetes (D), Diabetes + Low Dose Stevia (D + DDS) and Diabetes + High Dose Stevia (D + YDS) groups were formed. At the end of 15 days, oral glucose tolerance test was performed and liver-pancreas tissues were removed and homogenized. Fasting blood glucose levels of the animals at the beginning and end of the experiment and oral glucose tolerance test were performed at the end of the experiment. Biochemical parameters were measured by spectrophotometric method and gene expression was measured by RT-PCR method.Results: At the end of the experimental period, body weight and fasting blood glucose levels increased in D group when compared with both their initial values and the 15th day of the K group. In group D, lipid peroxidation (LPO), nitric oxide (NO) levels increased, superoxide dismutase (SOD) and glutathione S-transferase (GST) activities decreased. In group D, gene expression levels of leptin, fibroblast growth factor 21 (fbf21), interleukin 21 (1L21) and tumor necrosis factor alpha (tnfα) increased while dnmt3a expression level decreased.Conclusion: Stevia treatment corrected impaired oxidant antioxidant balance, gene expression levels and blood glucose levels in group D.İÇİNDEKİLERBEYAN ........................................................................................................................iTEŞEKKÜR ...............................................................................................................iiİÇİNDEKİLER .........................................................................................................iiiKISALTMALAR VE SİMGELER..........................................................................viTABLO LİSTESİ .......................................................................................................xRESİM LİSTESİ .......................................................................................................xiŞEKİL LİSTESİ ......................................................................................................xii1- ÖZET ......................................................................................................................12- ABSTRACT ...........................................................................................................23- GİRİŞ VE AMAÇ .................................................................................................34- yabet Hastalığı………………………………………………………………...54.1.1. Diyabet hastalığının sınıflandırılması…………………………………….......74.1.1.1. Tip 1 diyabet………………………………………………………………...74.1.1.2. Tip 2 diyabet………………………………...………………………………84.1.1.3. Gestasyonel diyabet…………………………..……………………………104.1.1.4. Monogenik diyabet-gençlerde görülen T2DM (MODY, maturity diabetes onset of the young) …………………………………….………………………....…124.2. Diyabet Hastalığının Klinik Belirtileri…………….……………………………124.2.1. Diyabetin primer etkileri…………………………………………..…………124.2.1.1. Hipoglisemi………………………………………………………....………124.2.1.2. Diyabetik ketoasidoz……………………………………………….………134.2.1.3. Açlık hiperglisemisi…………………………………………………..……134.2.1.4. Hiperglisemik hiperosmolar durum………………………………….……144.2.1.5. Laktik asidoz………………………………………………………………144.2.2. Diyabetin sekonder etkileri……….....………………………………………144.2.2.1.Kardiyovasküler hastalıklar…………...........………………………………144.2.2.2. Nefropati……………………………………........…………………………154.2.2.3. Retinopati………………………………………….......……………………174.2.2.4. Nöropati……………………………………………….........………………184.2.2.5. Diyabetik ayak……………………………………………..…….…………184.2.2.6. Oral sağlık………………………………………………….....……………204.2.2.7. Hamilelikle ilişkili diyabetik komplikasyonlar……………………………204.3. Tip 2 Diyabet Gelişiminde Etkili Moleküler Mekanizmalar...............................214.4. Tip 2 Diyabet ve Obezite İlişkisi……………………………………………….234.4.1. Leptin…………………………………………………………………………254.5. Fibroblast Büyüme Faktörü 21 (FGF21)……………………………………….264.6. Diyabet Gelişimindeki Epigenetik Faktörler…………………………...............274.6.1. DNMT3A ……………………………………………………………….........284.7. Tip 2 Diyabet Gelişimde İnflamasyonun Rolü…………………........................314.7.1. İnterlökin-21…………………………………………………………….........324.7.2. Tümör nekroz faktörü alfa (Tnf-alfa, Tnf-α)…………………………….....324.8. Tip 2 Diyabette Oksidan-Antioksidan Durum …………………………………354.9. Tatlandırıcılar …………………………………………………………………..384.9.1. Stevia rebaudiana……………………………………………..........................414.10. Zebra Balıklarında Oluşturulan Diyabet Modelleri……………………...........434.10.1. Fazla beslenme ile oluşturulan tip 2 diyabet modeli……………………..455. GEREÇ ve YÖNTEM5.1. Zebra Balıkları Bakım ve Beslenme Prosedürü………………………………...485.2. Kullanılan Cihazlar……………………………………………………………..495.3. Kullanılan Kimyasallar…………………………………………………………495.4. Maruziyet Grupları……………………………………………………………...515.5. Maruziyet Uygulaması…………………………………………………….........515.6. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT)………………………….………………..525.7. Oksidan ve Antioksidan Parametrelerinin İncelenmesi………………………...545.7.1. Parametreler için tayin yöntemleri……………………………………….......545.7.1.1. Total protein tayini ………………………………........................................545.7.1.2. Lipit peroksidasyon (LPO) tayini ………….................................................565.7.1.3. Total nitrik oksid tayini…………...........................…………………...........575.7.1.4. SOD aktivitesi tayini ……………………………........................................595.7.1.5. GST aktivitesi tayini......................................................................................605.8. Gen İfadesi Analizi (RT-PCR)…………………………….................................625.8.1. Delta delta Ct metodu ile veri analizi ……………………………...................625.9. İstatistiksel Analizi……………………………...................................................636. BULGULAR6.1. Grupların 15.gün Vücut Ağırlıkları Karşılaştırması............................................646.2. Kan Glukoz Değerleri………………………………………………..…………656.2.1. Başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerleri………………….…….……..656.2.2. 15. gün açlık kan glukoz değerleri……………………………...................666.2.3. Grupların 0-15. gün açlık kan glukoz değerleri karşılaştırması……….….676.2.4. Grupların oral glukoz test sonuçlarının karşılaştırılması………….…........686.3. Oksidan-Antioksidan Sistem Parametreleri ……………………………...........696.3.1. Grupların lipit peroksidasyon (LPO) analizi sonuçları…………………….…696.3.2. Grupların süperoksit dismutaz (SOD) analizi sonuçları………………….…..706.3.3. Grupların glutatyon S-transferaz (GST) analizi sonuçları……………….…...716.3.4. Gruplarınnitrit oksit (NO) analizi sonuçları………………...........…….........726.4. RT-PCR Analizi Sonuçları……………………………………………….….....736.4.1. fgf21 mRNA ekspresyon analizi sonuçları……………………………...........736.4.2. dnmt3amRNA ekspresyon analizi sonuçları…………………………….........746.4.3. lepamRNA ifade analizi sonuçları……………………………........................756.4.4. IL21mRNA ifade analizi sonuçları…………………………….......................766.4.5. tnf αmRNA ifade analizi sonuçları…………………………….......................777. TARTIŞMA ve SONUÇ……………………………...........................................788. KAYNAKLAR…………………………….........................................................879.EKLEREK-1. Ulusalararası Kongre Bildiri Özeti…………………………….......................95EK-2. Etik Kurul Onayı……………………………..................................................9610. ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………97KISALTMALAR VE SİMGELER LİSTESİ(H2O2): Hidrojen peroksit(NO): Nitrik oksit(O2): Oksijen(O2.-): Superoksit anyone(OH.): Hidroksi radikali(ONOO-): Peroksinitritα: Alfa actb1: Beta aktinACR: Albumin/ Kreatinin oranıADA: Amerikan Diyabet Birliği ADP: Adenozin difosfatAsk1: Apoptoz sinyal düzenleyici kinaz 1ATP: Adenozin trifosfatATPaz: Adenozin trifosfatı, adenozin difosfat ve ortofosfata hidrolizleyen enzimβ: BetaCa2+: Kalsiyum iyonuCAT: KatalazCDC: Hastalık kontrol ve önleme merkezleriDKA: Diyabetik KetoasidozDM: Diabetes MellitusDMSO: Dimetil SülfoksitcDNA: Kopya DNA Ct: Eşik döngü sayısıCu-Zn-SOD: Cu/ Zn superoksit dismutazCyp2D: Sitokrom P450 2DD:DiyabetD+DDS: Diyabet + Düşük Doz SteviaD+YDS:Diyabet + Yüksek Doz SteviaDNA:Deoksiribo nükleik asitENU: N-Etil-N-NitrosüreFADH2: Flavin adenin dinükleotidFDA: Besin ve İlaç YönetimiFBG: Fazla beslenen grupFGF-21: Fibroblast büyüme faktörü 21γ: Gama GDM: Gestasyonel DiyabetGLUT: Glukoz TaşıyıcıGRAS: Genel olarak kullanımı güvenliGSH:GlutatyonGSH: L-GlutatyonGST: Glutatyon S-transferazHbA1c: Glikozile HemoglobinHCl: Hidroklorik asitHd: Periventriküler hipotalamus’un dorsal bölgesiHEPES: 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineethansulfonik asitHGMD: İnsan Gen Mutasyon VeritabanıIDF: International Diabetes FederationIFN-γ: İnterferon-γIRS: İnsülin reseptör substratıK: KontrolK+: Potasyum iyonuK2HPO4: Dipotasyum hidrojen fosfatKH2PO4: Potasyum dihidrojen fosfatKoQ10: Koenzim Q10LDL: Düşük yoğunluklu lipoproteinLNCS: Düşük ya da sıfır kalorili tatlandırıcıMDA: MalondialdehitmRNA: Mesajcı ribo nükleik asitNa2HPO4: Disodyum hidrojen fosfatNa+: Sodyum iyonuNaCl: Sodyum klorürNAD(P)H: Nikotinamid adenin dinukleotit fosfatNADH: Nikotinamit adenin dinükleotidNa-EDTA: Sodyum etilendiamin tetraasedik asitNaOH: Sodyum hidoksitNEDD: N-(1-Naftil)-etilendiamin dihidroklorürNOS: Nitrik oksit sentazNTR: NitroredüktazOECD: Ekonomik Kalkınma ve İşbirliği ÖrgütüOGTT: Oral glukoz tolerans testiPBS: Fosfat tampon tuzu tabletpH: Hidrojenin gücüROT: Reaktif oksijen türleriSer/ Thr: Serin/ ThreoninSOD: Superoksit dismutazSULF: SülfaniamidSVG: Steviol glukuronitTBA: Triklorasetik asitTCA: Tiyobarbürik asitTDD: Türkiye Diyabet Derneği TNF-α: Tümör nekroz faktör-αT1DM: Tip 1 diyabetT2DM: Tip 2 diyabetVCl3: Vanadyum (III) KlorürWHO: Dünya sağlık örgütüZnSO4: Çinko sülfatTABLOLAR LİSTESİTablo 1:Genel diyabet tanı kriterleri Tablo 2: Deneylerde kullanılan cihazlarTablo 3: Kullanılan kimyasallar listesiTablo 4: Total protein tayini yöntemiTablo 5: Lipit peroksidasyon tayin yöntemiTablo 6: Nitrik oksit tayin yöntemiTablo 7: Superoksit dismutaz tayin yöntemiTablo 8: GST tayin yöntemiRESİM LİSTESİResim 1: Stevia rebaudianaResim 2: ZEBTEC Mini Akvaryum sistemiResim3:Çalışmamızda gerçekleştirilen kan alımı uygulamasına ait görüntüResim4:Çalışmamızda mikropipet yardımıyla yapılan gavaj uygulamasına ait görüntüŞEKİLLER LİSTESİŞekil 1:DNA metiltransferazların (DNMT) replikasyonda (A) ve De Nova Metilasyonda İşlevleriŞekil 2: Steviol glikozitlerin iskeleti (A), Stevioside (B), Rebaudioside A (C)Şekil 3:Kan alımı yapılan dorsal aort damarının konumuŞekil 4:Grupların 15.gün vücut ağırlıkları karşılaştırması grafiğiŞekil 5:Grupların başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil 6:Grupların başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil7:Grupların başlangıç (0.gün) ve 15. gün açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil 8:Grupların başlangıç oral glukoz tolerans test sonuçları grafiği (15.gün) Şekil 9: Grupların lipit peroksidasyon değerlerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 10: Grupların süperoksit dismutaz aktivitelerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 11: Grupların glutatyon S-transferaz aktivitelerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 12: Grupların nitrik oksit değerlerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 13:Grupların fgf21mRNA ekspresyon analizi grafiğiŞekil 14:Grupların dnmt3amRNA ekspresyon analizigrafiğiŞekil 15: Grupların lepamRNA ekspresyon analizigrafiğiŞekil 16: K ve maruziyet gruplarının IL21mRNA ifade analizi grafiğiŞekil 17: K ve maruziyet gruplarının tnfαmRNA ifade analizi grafiği
Investigation of the Possible Effects of Stevia rebaudiana on Type 2 Diabetes Model in ZebrafishName of the Student: Esra DandinAdviser: Prof.Dr. Ebru Işık AlturfanDepartment:Department of Biochemistry, Faculty of Pharmacy2.ABSTRACTObjective: The aim of this study was to investigate the possible effects of Stevia rebaudiana in a model of type 2 diabetes mellitus induced by overnutrition in zebrafish.Materials and Methods: Adult zebrafish were exposed to overfeeding and low and high doses ofStevia rebaudianafor 15 days. Accordingly, Control (K), Diabetes (D), Diabetes + Low Dose Stevia (D + DDS) and Diabetes + High Dose Stevia (D + YDS) groups were formed. At the end of 15 days, oral glucose tolerance test was performed and liver-pancreas tissues were removed and homogenized. Fasting blood glucose levels of the animals at the beginning and end of the experiment and oral glucose tolerance test were performed at the end of the experiment. Biochemical parameters were measured by spectrophotometric method and gene expression was measured by RT-PCR method.Results: At the end of the experimental period, body weight and fasting blood glucose levels increased in D group when compared with both their initial values and the 15th day of the K group. In group D, lipid peroxidation (LPO), nitric oxide (NO) levels increased, superoxide dismutase (SOD) and glutathione S-transferase (GST) activities decreased. In group D, gene expression levels of leptin, fibroblast growth factor 21 (fbf21), interleukin 21 (1L21) and tumor necrosis factor alpha (tnfα) increased while dnmt3a expression level decreased.Conclusion: Stevia treatment corrected impaired oxidant antioxidant balance, gene expression levels and blood glucose levels in group D.İÇİNDEKİLERBEYAN ........................................................................................................................iTEŞEKKÜR ...............................................................................................................iiİÇİNDEKİLER .........................................................................................................iiiKISALTMALAR VE SİMGELER..........................................................................viTABLO LİSTESİ .......................................................................................................xRESİM LİSTESİ .......................................................................................................xiŞEKİL LİSTESİ ......................................................................................................xii1- ÖZET ......................................................................................................................12- ABSTRACT ...........................................................................................................23- GİRİŞ VE AMAÇ .................................................................................................34- yabet Hastalığı………………………………………………………………...54.1.1. Diyabet hastalığının sınıflandırılması…………………………………….......74.1.1.1. Tip 1 diyabet………………………………………………………………...74.1.1.2. Tip 2 diyabet………………………………...………………………………84.1.1.3. Gestasyonel diyabet…………………………..……………………………104.1.1.4. Monogenik diyabet-gençlerde görülen T2DM (MODY, maturity diabetes onset of the young) …………………………………….………………………....…124.2. Diyabet Hastalığının Klinik Belirtileri…………….……………………………124.2.1. Diyabetin primer etkileri…………………………………………..…………124.2.1.1. Hipoglisemi………………………………………………………....………124.2.1.2. Diyabetik ketoasidoz……………………………………………….………134.2.1.3. Açlık hiperglisemisi…………………………………………………..……134.2.1.4. Hiperglisemik hiperosmolar durum………………………………….……144.2.1.5. Laktik asidoz………………………………………………………………144.2.2. Diyabetin sekonder etkileri……….....………………………………………144.2.2.1.Kardiyovasküler hastalıklar…………...........………………………………144.2.2.2. Nefropati……………………………………........…………………………154.2.2.3. Retinopati………………………………………….......……………………174.2.2.4. Nöropati……………………………………………….........………………184.2.2.5. Diyabetik ayak……………………………………………..…….…………184.2.2.6. Oral sağlık………………………………………………….....……………204.2.2.7. Hamilelikle ilişkili diyabetik komplikasyonlar……………………………204.3. Tip 2 Diyabet Gelişiminde Etkili Moleküler Mekanizmalar...............................214.4. Tip 2 Diyabet ve Obezite İlişkisi……………………………………………….234.4.1. Leptin…………………………………………………………………………254.5. Fibroblast Büyüme Faktörü 21 (FGF21)……………………………………….264.6. Diyabet Gelişimindeki Epigenetik Faktörler…………………………...............274.6.1. DNMT3A ……………………………………………………………….........284.7. Tip 2 Diyabet Gelişimde İnflamasyonun Rolü…………………........................314.7.1. İnterlökin-21…………………………………………………………….........324.7.2. Tümör nekroz faktörü alfa (Tnf-alfa, Tnf-α)…………………………….....324.8. Tip 2 Diyabette Oksidan-Antioksidan Durum …………………………………354.9. Tatlandırıcılar …………………………………………………………………..384.9.1. Stevia rebaudiana……………………………………………..........................414.10. Zebra Balıklarında Oluşturulan Diyabet Modelleri……………………...........434.10.1. Fazla beslenme ile oluşturulan tip 2 diyabet modeli……………………..455. GEREÇ ve YÖNTEM5.1. Zebra Balıkları Bakım ve Beslenme Prosedürü………………………………...485.2. Kullanılan Cihazlar……………………………………………………………..495.3. Kullanılan Kimyasallar…………………………………………………………495.4. Maruziyet Grupları……………………………………………………………...515.5. Maruziyet Uygulaması…………………………………………………….........515.6. Oral Glukoz Tolerans Testi (OGTT)………………………….………………..525.7. Oksidan ve Antioksidan Parametrelerinin İncelenmesi………………………...545.7.1. Parametreler için tayin yöntemleri……………………………………….......545.7.1.1. Total protein tayini ………………………………........................................545.7.1.2. Lipit peroksidasyon (LPO) tayini ………….................................................565.7.1.3. Total nitrik oksid tayini…………...........................…………………...........575.7.1.4. SOD aktivitesi tayini ……………………………........................................595.7.1.5. GST aktivitesi tayini......................................................................................605.8. Gen İfadesi Analizi (RT-PCR)…………………………….................................625.8.1. Delta delta Ct metodu ile veri analizi ……………………………...................625.9. İstatistiksel Analizi……………………………...................................................636. BULGULAR6.1. Grupların 15.gün Vücut Ağırlıkları Karşılaştırması............................................646.2. Kan Glukoz Değerleri………………………………………………..…………656.2.1. Başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerleri………………….…….……..656.2.2. 15. gün açlık kan glukoz değerleri……………………………...................666.2.3. Grupların 0-15. gün açlık kan glukoz değerleri karşılaştırması……….….676.2.4. Grupların oral glukoz test sonuçlarının karşılaştırılması………….…........686.3. Oksidan-Antioksidan Sistem Parametreleri ……………………………...........696.3.1. Grupların lipit peroksidasyon (LPO) analizi sonuçları…………………….…696.3.2. Grupların süperoksit dismutaz (SOD) analizi sonuçları………………….…..706.3.3. Grupların glutatyon S-transferaz (GST) analizi sonuçları……………….…...716.3.4. Gruplarınnitrit oksit (NO) analizi sonuçları………………...........…….........726.4. RT-PCR Analizi Sonuçları……………………………………………….….....736.4.1. fgf21 mRNA ekspresyon analizi sonuçları……………………………...........736.4.2. dnmt3amRNA ekspresyon analizi sonuçları…………………………….........746.4.3. lepamRNA ifade analizi sonuçları……………………………........................756.4.4. IL21mRNA ifade analizi sonuçları…………………………….......................766.4.5. tnf αmRNA ifade analizi sonuçları…………………………….......................777. TARTIŞMA ve SONUÇ……………………………...........................................788. KAYNAKLAR…………………………….........................................................879.EKLEREK-1. Ulusalararası Kongre Bildiri Özeti…………………………….......................95EK-2. Etik Kurul Onayı……………………………..................................................9610. ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………97KISALTMALAR VE SİMGELER LİSTESİ(H2O2): Hidrojen peroksit(NO): Nitrik oksit(O2): Oksijen(O2.-): Superoksit anyone(OH.): Hidroksi radikali(ONOO-): Peroksinitritα: Alfa actb1: Beta aktinACR: Albumin/ Kreatinin oranıADA: Amerikan Diyabet Birliği ADP: Adenozin difosfatAsk1: Apoptoz sinyal düzenleyici kinaz 1ATP: Adenozin trifosfatATPaz: Adenozin trifosfatı, adenozin difosfat ve ortofosfata hidrolizleyen enzimβ: BetaCa2+: Kalsiyum iyonuCAT: KatalazCDC: Hastalık kontrol ve önleme merkezleriDKA: Diyabetik KetoasidozDM: Diabetes MellitusDMSO: Dimetil SülfoksitcDNA: Kopya DNA Ct: Eşik döngü sayısıCu-Zn-SOD: Cu/ Zn superoksit dismutazCyp2D: Sitokrom P450 2DD:DiyabetD+DDS: Diyabet + Düşük Doz SteviaD+YDS:Diyabet + Yüksek Doz SteviaDNA:Deoksiribo nükleik asitENU: N-Etil-N-NitrosüreFADH2: Flavin adenin dinükleotidFDA: Besin ve İlaç YönetimiFBG: Fazla beslenen grupFGF-21: Fibroblast büyüme faktörü 21γ: Gama GDM: Gestasyonel DiyabetGLUT: Glukoz TaşıyıcıGRAS: Genel olarak kullanımı güvenliGSH:GlutatyonGSH: L-GlutatyonGST: Glutatyon S-transferazHbA1c: Glikozile HemoglobinHCl: Hidroklorik asitHd: Periventriküler hipotalamus’un dorsal bölgesiHEPES: 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineethansulfonik asitHGMD: İnsan Gen Mutasyon VeritabanıIDF: International Diabetes FederationIFN-γ: İnterferon-γIRS: İnsülin reseptör substratıK: KontrolK+: Potasyum iyonuK2HPO4: Dipotasyum hidrojen fosfatKH2PO4: Potasyum dihidrojen fosfatKoQ10: Koenzim Q10LDL: Düşük yoğunluklu lipoproteinLNCS: Düşük ya da sıfır kalorili tatlandırıcıMDA: MalondialdehitmRNA: Mesajcı ribo nükleik asitNa2HPO4: Disodyum hidrojen fosfatNa+: Sodyum iyonuNaCl: Sodyum klorürNAD(P)H: Nikotinamid adenin dinukleotit fosfatNADH: Nikotinamit adenin dinükleotidNa-EDTA: Sodyum etilendiamin tetraasedik asitNaOH: Sodyum hidoksitNEDD: N-(1-Naftil)-etilendiamin dihidroklorürNOS: Nitrik oksit sentazNTR: NitroredüktazOECD: Ekonomik Kalkınma ve İşbirliği ÖrgütüOGTT: Oral glukoz tolerans testiPBS: Fosfat tampon tuzu tabletpH: Hidrojenin gücüROT: Reaktif oksijen türleriSer/ Thr: Serin/ ThreoninSOD: Superoksit dismutazSULF: SülfaniamidSVG: Steviol glukuronitTBA: Triklorasetik asitTCA: Tiyobarbürik asitTDD: Türkiye Diyabet Derneği TNF-α: Tümör nekroz faktör-αT1DM: Tip 1 diyabetT2DM: Tip 2 diyabetVCl3: Vanadyum (III) KlorürWHO: Dünya sağlık örgütüZnSO4: Çinko sülfatTABLOLAR LİSTESİTablo 1:Genel diyabet tanı kriterleri Tablo 2: Deneylerde kullanılan cihazlarTablo 3: Kullanılan kimyasallar listesiTablo 4: Total protein tayini yöntemiTablo 5: Lipit peroksidasyon tayin yöntemiTablo 6: Nitrik oksit tayin yöntemiTablo 7: Superoksit dismutaz tayin yöntemiTablo 8: GST tayin yöntemiRESİM LİSTESİResim 1: Stevia rebaudianaResim 2: ZEBTEC Mini Akvaryum sistemiResim3:Çalışmamızda gerçekleştirilen kan alımı uygulamasına ait görüntüResim4:Çalışmamızda mikropipet yardımıyla yapılan gavaj uygulamasına ait görüntüŞEKİLLER LİSTESİŞekil 1:DNA metiltransferazların (DNMT) replikasyonda (A) ve De Nova Metilasyonda İşlevleriŞekil 2: Steviol glikozitlerin iskeleti (A), Stevioside (B), Rebaudioside A (C)Şekil 3:Kan alımı yapılan dorsal aort damarının konumuŞekil 4:Grupların 15.gün vücut ağırlıkları karşılaştırması grafiğiŞekil 5:Grupların başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil 6:Grupların başlangıç (0.gün) açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil7:Grupların başlangıç (0.gün) ve 15. gün açlık kan glukoz değerlerikarşılaştırılması grafiğiŞekil 8:Grupların başlangıç oral glukoz tolerans test sonuçları grafiği (15.gün) Şekil 9: Grupların lipit peroksidasyon değerlerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 10: Grupların süperoksit dismutaz aktivitelerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 11: Grupların glutatyon S-transferaz aktivitelerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 12: Grupların nitrik oksit değerlerinin karşılaştırılması grafiğiŞekil 13:Grupların fgf21mRNA ekspresyon analizi grafiğiŞekil 14:Grupların dnmt3amRNA ekspresyon analizigrafiğiŞekil 15: Grupların lepamRNA ekspresyon analizigrafiğiŞekil 16: K ve maruziyet gruplarının IL21mRNA ifade analizi grafiğiŞekil 17: K ve maruziyet gruplarının tnfαmRNA ifade analizi grafiği