Publication: Levofloksasin’in insan nötrofillerinde hücre içi öldürme fonksiyonu üzerine etkisinin in vitro değerlendirilmesi
Abstract
LEVOFLOKSASİN'İN İNSAN NÖTROFİLLERİNDE HÜCRE İÇİ ÖLDÜRME FONKSİYONU ÜZERİNE ETKİSİNİN İN VİTRO DEĞERLENDİRİLMESİ Adı ve Soyadı: Hümeyra COMERTER Danışman: Prof. Dr. Fikret Vehbi İZZETTİN Program: Yüksek lisans Farmakoloji Eczacılık Bilim Dalı
Çalışmamızı iki amaca yönelik olarak tasarladık. Birinci amacımız nötrofilleri farklı terapötik konsantrasyonlarda levofloksasin ile inkübe ederek fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarını in vitro ortamda incelemek; ikinci amacımız ise tablet ve hammadde formlarını kullanarak bu iki formun nötrofil fonksiyonlarına etkilerinin farklı olup olmadığını araştırmaktı. Bu amaçlara ulaşabilmek için levofloksasinin farklı konsantrasyonlarda stok çözeltilerini (1,4 mg/ mL, 2,8 mg/ mL, 5,7 mg/ mL, 11,4 mg/ mL) hazırladık. Çalışmamızda kullandığımız saf insan nötrofilleri sağlıklı gönüllülerden elde edilerek, 37 0C'de 30 dakika farklı levofloksasin konsantrasyonları ile inkübe edildi. Nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarının değerlendirilmesinde levofloksasinin antimikrobiyal etkinlik göstermediği Candida albicans suşu tercih edildi. 2,8 mg/ mL'lik hammadde ve tablet dozaj formundan hazırlanan çözeltiler ile nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre azalma izlendi; ancak sadece 2,8 mg/ mL'lik tablet çözeltisi ile nötrofillerin fagositoz fonksiyonunda kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı azalma bulundu (p<0,05). Levofloksasinin 5,7 mg/ mL tablet dozaj formundan hazırlanan çözeltisi ile nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre azalma görüldü; ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. 5,7 mg/ mL hammaddeden hazırlanan çözelti ile ise nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre artma izlendi; ancak bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p<0,05). Levofloksasinin 2,8 mg/ mL tablet formundan hazırlanan çözeltisi ile, 2,8 mg/ mL hammaddeden hazırlanan çözeltisine oranla nötrofillerin fagositik ve hücre içi öldürme etkilerinin azaldığı izlendi; ancak sadece nötrofillerin fagositik fonksiyonunda izlenen azalma istatistiksel olarak anlamlı bulundu. 5,7 mg/ mL'lik tablet çözeltisi ile, 5,7 mg/ mL'lik hammadde çözeltisine oranla nötrofillerin fagositik ve hücre içi öldürme etkilerinin azaldığı izlendi; tablet dozaj formu solüsyonu ile izlenen bu azalmalar istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05). Levofloksasin 11,4 mg/ mL'lik hammadde çözeltisi ile nötrofillerin fagositoz fonksiyonu kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azalırken, hücre içi öldürme fonksiyonunda izlenen azalma anlamlı bulunmadı. 1,4 mg/ mL'lik hammadde çözeltisi ile yapılan deneyde ise fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre anlamlı olmayan azalma saptandı (p<0,05). Sonuç olarak; farklı konsantrasyonlardaki levofloksasinin nötrofil fonksiyonlarını farklı yönde etkilediği izlendi. Tablet dozaj formundan hazırlanan çözeltiler ile inkübe edilen nötrofillerde hammadde çözeltileri ile inkübe edilen nötrofillere oranla fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonları üzerine anlamlı inhibsiyon saptandı. Elde edilen sonuçların klinikte kullanımı ile ilgisini değerlendirmek üzere in vivo çalışmaların yapılması gerektiğini düşünüyoruz. Ayrıca antimikrobiyal ilaçların mikrobisid etkinliklerinin yanısıra immünomodülatör etkilerinin de incelenmesi gerektiğine inanıyoruz. SUMMARY AN IN VITRO DETERMINATION OF THE EFFECT OF LEVOFLOXACIN ON THE INTRACELLULAR KILLING FUNCTION OF HUMAN NEUTROPHILS This study was designed to meet two main objectives. Firstly, to investigate the effects of levofloxacin on the in vitro phagocytic and intracellular killing functions of human neutrophils at different therapeutic concentrations. The second objective was to examine the possible differences between pure powder and commercially available tablet dosage forms of levofloxacin on the neutrophil functions. In order two achieve these two objectives we prepared stock solutions separately from both pure powder and tablet dosage forms at concentrations of 1,4 mg/ mL, 2,8 mg/ mL, 5,7 mg/ mL and 11,4 mg/ mL. Isolated neutrophil preparations, used in this study, were obtained from healthy volunteers and incubated for 30 minutes at 37 0C with levofloxacin at the above specified concentrations. In order to identify any levofloxacin induced immunomodulated intracellular killing potential, as opposed to the agent's direct antimicrobial effect we used a strain of Candida albicans against which the drug has no natural fungicidal activity. At concentrations of 2,8 mg/ mL solutions, prepared from both pure powder and tablet dosage form of levofloxacin, were observed to decrease phagocytosis and intracellular killing comparing to control samples, but this was only statistically significant for the tablet dosage form's effect on phagocytic function. At concentration of 5,7 mg/ mL solution, prepared from pure levofloxacin, was observed to stimulate small increases in both phagocytic and intracellular killing comparing to control. By contrast, the solution of tablet dosage form produced a slight decrease in both phagocytic and intracellular killing functions. Comparing to control the results at this concentration were not however statistically significant (p<0,05). At concentration of 2,8 mg/ mL solution, prepared from tablet dosage form of levofloxacin, was observed to decrease phagocytosis and intracellular killing comparing to 2,8 mg/ mL solution prepared from pure powder of levofloxacin; but this was only statistically significant for the effect on phagocytic function (p<0,05). At concentration of 5,7 mg/ mL solution, prepared from tablet dosage form of levofloxacin, was observed to decrease phagocytosis and intracellular killing comparing to 5,7 mg/ mL solution prepared from pure powder of levofloxacin; these decreases were statistically significant (p<0,05). At concentrations of 1,4 mg/ mL (subtherapeutic) and 11,4 mg/ mL (about twice the therapeutic level) solutions prepared from pure levofloxacin produced decreases both in phagocytic and intracellular killing functions comparing to control; nevertheless, this was only significant for the phagocytic effect at concentration of 11,4 mg/ mL solution prepared from pure powder levofloxacin. In conclusion, different effects on neutrophil functions were recorded with varying concentrations of levofloxacin solutions. Those solutions prepared from tablet dosage forms of levofloxacin at therapeutic concentrations have inhibitory effects both on phagocytosis and intracellular killing compared to control solutions. This inhibitory effect displayed by the tablet forms is more pronounced than that of equivalent concentrations of pure levofloxacin powder. We do, however, believe that in vivo studies are needed to assess the clinical relevance of these findings. Furthermore, in our opinion, besides the investigation of the microbicidal aspects of antimicrobials, their immunomodulatory effects should also be examined.
Çalışmamızı iki amaca yönelik olarak tasarladık. Birinci amacımız nötrofilleri farklı terapötik konsantrasyonlarda levofloksasin ile inkübe ederek fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarını in vitro ortamda incelemek; ikinci amacımız ise tablet ve hammadde formlarını kullanarak bu iki formun nötrofil fonksiyonlarına etkilerinin farklı olup olmadığını araştırmaktı. Bu amaçlara ulaşabilmek için levofloksasinin farklı konsantrasyonlarda stok çözeltilerini (1,4 mg/ mL, 2,8 mg/ mL, 5,7 mg/ mL, 11,4 mg/ mL) hazırladık. Çalışmamızda kullandığımız saf insan nötrofilleri sağlıklı gönüllülerden elde edilerek, 37 0C'de 30 dakika farklı levofloksasin konsantrasyonları ile inkübe edildi. Nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarının değerlendirilmesinde levofloksasinin antimikrobiyal etkinlik göstermediği Candida albicans suşu tercih edildi. 2,8 mg/ mL'lik hammadde ve tablet dozaj formundan hazırlanan çözeltiler ile nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre azalma izlendi; ancak sadece 2,8 mg/ mL'lik tablet çözeltisi ile nötrofillerin fagositoz fonksiyonunda kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı azalma bulundu (p<0,05). Levofloksasinin 5,7 mg/ mL tablet dozaj formundan hazırlanan çözeltisi ile nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre azalma görüldü; ancak bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. 5,7 mg/ mL hammaddeden hazırlanan çözelti ile ise nötrofillerin fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre artma izlendi; ancak bu artış istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p<0,05). Levofloksasinin 2,8 mg/ mL tablet formundan hazırlanan çözeltisi ile, 2,8 mg/ mL hammaddeden hazırlanan çözeltisine oranla nötrofillerin fagositik ve hücre içi öldürme etkilerinin azaldığı izlendi; ancak sadece nötrofillerin fagositik fonksiyonunda izlenen azalma istatistiksel olarak anlamlı bulundu. 5,7 mg/ mL'lik tablet çözeltisi ile, 5,7 mg/ mL'lik hammadde çözeltisine oranla nötrofillerin fagositik ve hücre içi öldürme etkilerinin azaldığı izlendi; tablet dozaj formu solüsyonu ile izlenen bu azalmalar istatistiksel olarak anlamlı bulundu (p<0,05). Levofloksasin 11,4 mg/ mL'lik hammadde çözeltisi ile nötrofillerin fagositoz fonksiyonu kontrole göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azalırken, hücre içi öldürme fonksiyonunda izlenen azalma anlamlı bulunmadı. 1,4 mg/ mL'lik hammadde çözeltisi ile yapılan deneyde ise fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonlarında kontrole göre anlamlı olmayan azalma saptandı (p<0,05). Sonuç olarak; farklı konsantrasyonlardaki levofloksasinin nötrofil fonksiyonlarını farklı yönde etkilediği izlendi. Tablet dozaj formundan hazırlanan çözeltiler ile inkübe edilen nötrofillerde hammadde çözeltileri ile inkübe edilen nötrofillere oranla fagositoz ve hücre içi öldürme fonksiyonları üzerine anlamlı inhibsiyon saptandı. Elde edilen sonuçların klinikte kullanımı ile ilgisini değerlendirmek üzere in vivo çalışmaların yapılması gerektiğini düşünüyoruz. Ayrıca antimikrobiyal ilaçların mikrobisid etkinliklerinin yanısıra immünomodülatör etkilerinin de incelenmesi gerektiğine inanıyoruz. SUMMARY AN IN VITRO DETERMINATION OF THE EFFECT OF LEVOFLOXACIN ON THE INTRACELLULAR KILLING FUNCTION OF HUMAN NEUTROPHILS This study was designed to meet two main objectives. Firstly, to investigate the effects of levofloxacin on the in vitro phagocytic and intracellular killing functions of human neutrophils at different therapeutic concentrations. The second objective was to examine the possible differences between pure powder and commercially available tablet dosage forms of levofloxacin on the neutrophil functions. In order two achieve these two objectives we prepared stock solutions separately from both pure powder and tablet dosage forms at concentrations of 1,4 mg/ mL, 2,8 mg/ mL, 5,7 mg/ mL and 11,4 mg/ mL. Isolated neutrophil preparations, used in this study, were obtained from healthy volunteers and incubated for 30 minutes at 37 0C with levofloxacin at the above specified concentrations. In order to identify any levofloxacin induced immunomodulated intracellular killing potential, as opposed to the agent's direct antimicrobial effect we used a strain of Candida albicans against which the drug has no natural fungicidal activity. At concentrations of 2,8 mg/ mL solutions, prepared from both pure powder and tablet dosage form of levofloxacin, were observed to decrease phagocytosis and intracellular killing comparing to control samples, but this was only statistically significant for the tablet dosage form's effect on phagocytic function. At concentration of 5,7 mg/ mL solution, prepared from pure levofloxacin, was observed to stimulate small increases in both phagocytic and intracellular killing comparing to control. By contrast, the solution of tablet dosage form produced a slight decrease in both phagocytic and intracellular killing functions. Comparing to control the results at this concentration were not however statistically significant (p<0,05). At concentration of 2,8 mg/ mL solution, prepared from tablet dosage form of levofloxacin, was observed to decrease phagocytosis and intracellular killing comparing to 2,8 mg/ mL solution prepared from pure powder of levofloxacin; but this was only statistically significant for the effect on phagocytic function (p<0,05). At concentration of 5,7 mg/ mL solution, prepared from tablet dosage form of levofloxacin, was observed to decrease phagocytosis and intracellular killing comparing to 5,7 mg/ mL solution prepared from pure powder of levofloxacin; these decreases were statistically significant (p<0,05). At concentrations of 1,4 mg/ mL (subtherapeutic) and 11,4 mg/ mL (about twice the therapeutic level) solutions prepared from pure levofloxacin produced decreases both in phagocytic and intracellular killing functions comparing to control; nevertheless, this was only significant for the phagocytic effect at concentration of 11,4 mg/ mL solution prepared from pure powder levofloxacin. In conclusion, different effects on neutrophil functions were recorded with varying concentrations of levofloxacin solutions. Those solutions prepared from tablet dosage forms of levofloxacin at therapeutic concentrations have inhibitory effects both on phagocytosis and intracellular killing compared to control solutions. This inhibitory effect displayed by the tablet forms is more pronounced than that of equivalent concentrations of pure levofloxacin powder. We do, however, believe that in vivo studies are needed to assess the clinical relevance of these findings. Furthermore, in our opinion, besides the investigation of the microbicidal aspects of antimicrobials, their immunomodulatory effects should also be examined.