Production and purification of RTEM-1 beta - lactamase and ITS inhibition by peptides

Abstract

RTEM-1 Β-LAKTAMAZ’IN ÜRETİMİ, SAFLAŞTIRILMASI VE PEPTİTLER İLE İNHİBİSYONU β-laktam antibiyotikleri yüksek etki, düşük fiyat ve minimum yan etkilerinden dolayı yaygın kullanılan antibiyotiklerdendir. Bu antibiyotiklerin sık ve aşırı kullanımı ise bakterilerin bu ilaçlara direnç geliştirmesine neden olmaktadır. β-laktam antibiyotiklerine karşı en yaygın rastlanan direnç; Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler tarafından sentezlenen ve β-laktam antibiyotiklerinin β-laktam halkalarının kırılmasına neden olan β-laktamaz enziminin sentezi ile meydana gelmektedir. 263 amino asit uzunluğunda periplazmik bir protein olan RTEM-1 β-laktamaz, A sınıfı bir β-laktamaz olup penisilin, sefalosporin gibi antibiyotikleri hidrolize edebilmektedir. Streptomyces clavuligerus tarafından üretilen 165 amino asitlik β-laktamaz inhibitör proteini (BLIP) TEM-1, SHV-1 gibi A sınıfı β-laktamazlara farklı ilgilerle bağlanarak onları inhibe edebilmektedir. Bu çalışmanın amacı RTEM-1 β-laktamazı saflaştırmak ve BLIP ile RTEM-1 β-laktamazın hücre içi koşullarda bağlanma ve inhibisyon kinetiğini aydınlatmaktır. İki molekülün birbiriyle etkileşimi daha önce yapılmış in-vitro çalışmalarla doğrulanmıştır. Bu amaçla pUC18 vektörü içeren E. Coli TB1 hücrelerinde üretilen RTEM-1 β-laktamaz, periplazmik bir protein olması nedeniyle, ozmotik şok ile hücre dışına alındıktan sonra ultrafiltrasyonu takiben yapılan iyon değişim kromatografisi ile 5,1 kat saflaştırılmıştır. Enzimin saflığı sodyum dodesil sulfat poliakrilamit jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile kontrol edilmiştir. BLIP ile yapılan çalışmalar sonucunda, BLIP’in saflaştırılan enzimi yarışmasız inhibe ederken, saf ticari enzimi yarışmalı inhibe ettiği görülmüştür.

PRODUCTION AND PURIFICATION OF RTEM-1 B-LACTAMASE AND ITS INHIBITION BY PEPTIDES β-lactam antibiotics are the most commonly used antibiotics due to their high effectiveness, low cost, ease of delivery and minimal side effects. As a result of wide use of these antibiotics, bacteria render resistance to β-lactam antibiotics. One mechanism of β-lactam resistance is the synthesis of β-lactamase by both Gram-positive and Gram-negative bacteria. This enzyme hydrolyzes the amide bond of the β-lactam antibiotics causing them to be ineffective. The most prevalent β-lactamase is the class A RTEM-1 β-lactamase which is a periplasmic protein with 263 amino acids. Streptomyces clavuligerus produces a protein inhibitor of β-lactamase called β-lactamase inhibitor protein (BLIP) which is a 165 amino acid protein. BLIP inhibits class A β-lactamases such as TEM-1 or SHV-1 with varying degrees. The aim of this study was to purify β-lactamase and elucidate the intracellular binding and inhibition kinetics of BLIP and β-lactamase. The interaction of these molecules has previously been verified by in-vitro studies. The wild-type form of RTEM-1 β-lactamase has been produced by E. Coli TB1 pUC18 cells and purified 5.1 times from the periplasmic protein extract by ultrafiltration and ion exchange chromatography methods. Purified enzymes are used for subsequent β-lactamase assays. Competitive inhibition of commercial pure RTEM-1 β-lactamase by BLIP was demonstrated however BLIP was found to be an uncompetitive inhibitor of the purified periplasmic protein extract.