Fibrinojenin in vitro oksidasyonuna bağlı olarak yapısal değişimlerinin incelenmesi

Abstract

Proteinlerin oksidasyonunun bir bölümü, proteinin reaktif oksijen türleri ile direkt olarak veya oksidatif stresin ikincil ürünleri ile indirekt indüklenmesi ile meydana gelen bir kovalent modifikasyondur. Bu çalışmada Fe+3/ askorbat oksidatif sistemi kullanılarak in vitro fibrinojen oksidasyonu gerçekleştirildi. Fibrinojen modifikasyonu, oksidatif sistemin üç farklı konsantrasyonlarında (100µM/ 25mM, 200µM/ 50mM, 300µM/ 75mM) ve 6 farklı zaman aralıklarında (2, 6, 12, 18, 24, 48 saat, 37oC’ de) fibrinojen solüsyonunun inkübasyonu ile gerçekleştirildi. Spektrofotometrik analizle, Fe+3/ askorbat oksidatif sistemi ile modifiye edilen fibrinojen, doğal fibrinojen ile karşılaştırıldı. Yüksek konsatrasyonda (300µM/ 75mM) Fe+3/ askorbat ile 2, 6 ve 12 saat inkübe edilen örneklerde hızlı bir fibrinojen modifikasyonu ve buna bağlı olarak giderek artan dalga boyu ve optik dansite gözlendi. 18 saat ve üzeri inkübasyonlarda konsantrasyon farkının modifikasyon üzerindeki etkilerinin benzer olduğu spektrofotometrik değerlendirmelerle belirlendi. In vitro çalışmada fibrinojendeki trozin kaybı ile meydana gelen o-o-ditrozin yapısının, 48 saatlik inkübasyonun yarattığı modifikasyona bağlı olarak maksimum cm 308nm’ de karakteristik emisyonuyla oksidasyonun etkileri tespit edildi. İnkübasyon süresi ile modifikasyon şiddeti doğru orantılı olarak bulundu. HPLC analizinde doğal fibrinojen cm 280 nm’ de rt 5. dakikada elue edilirken, modifiye fibrinojen örneklerinin rt 7. ve 10. dakikalarda ana pikten ayrılma gösterdiği saptandı. SDS-PAGE analizinde doğal fibrinojene göre modifiye fibrinojende yapısal değişikliğe bağlı önemli bir degredasyon gözlenmedi. Tripsin ile metabolize edilen doğal ve modifiye fibrinojen mass spektrofotometre ile analiz edildi. Doğal fibrinojende gözlenen 527.4162 m/ z dominant iyon-kütle spektrumu, oksidatif formlarda 402.4464 m/ z olarak bulundu. Düşük molekül ağırlıklı ve yüksek molekül ağırlıklı mass spektrum range’ leri incelendiğinde, doğal fibrinojene göre Fe+3/ askorbat oksidatif sistemine maruz bırakılan örneklerde çok sayıda yüksek yoğunluklu iyon-kütle intensity tespit edildi.

Protein oxidation is defined as the covalent modification of a protein induced either directly by reactive oxygen species or indirectly by reactions with secondary by products of oxidative stress. In this study, we analysed in vitro exposure of fibrinogen to Fe+3/ ascorbate oxidative system resulted in structural modifications. Treatment of fibrinogen in three different concentrations (100µM/ 25mM, 200µM/ 50mM, 300µM/ 75mM) and in 6 different incubation times (2, 6, 12, 18, 24, 48 hours), at 37oC by oxidative system was evaluated. In spectrophotometric analysis differencies between native fibrinogen and modified fibrinogen upon exposure to the Fe+3/ ascorbate oxidative system were detected. Fibrinogen which was exposed to 2, 6 and 12h incubation times and high Fe+3/ ascorbate concentration (300µM/ 75Mm) was rapidly modified. We found increased exitation and optical density of modified fibrinogen when compared with native fibrinogen. No difference was found in fibrinogen modification exposed to 18 h and over incubation times with oxidative system. In vitro the presence of o-o-ditryosine in a protein molecule which is formed from fibrinogen by the loss of tyrosine was indicated potein modification of the characteristic emission at maximum cm 308nm. We observed that the incubation times and modification intensities were lineer. In the HPLC analysis, the elution of native fibrinogen was detected in one peak within rt:5th min. After modification of fibrinogen, two peaks were eluted at rt:7th and 10th minutes, completely resolved from the native fibrinogen.