Recombinant production of membrane active peptides

Abstract

Membran aktif peptidlerin rekombinant üretilmesi Aşırı ve bilinçsiz antibiyotik kullanımı, çoklu ilaç direnci taşıyan mikroorganizmaların hızla artmasına yol açmakta ve bu durum, Dünya Sağlık Örgütü tarafından toplum sağlığı için ciddi bir tehdit olarak kabul edilmektedir. Mikroorganizmalar, antibiyotiklere karşı direnç geliştirerek hayatta kalma yeteneklerini artırmaktadır. Böylelikle, doğada bulunan antimikrobiyal peptidler (AMPler), direnç gelişimine karşı gösterdikleri düşük potansiyel ve geniş etki spektrumu ile dikkat çekmektedir. AMP'ler, mikroorganizmalar üzerinde düşük konsantrasyonlarda bile öldürücü etki gösterebilmekte ve hızlı bir etkileşimle direnç gelişimini engellemektedir. Bu çalışmada, Luffin P1 adlı ribozom inaktive edici antimikrobiyal peptidin Corynebacterium glutamicum WT hücrelerinde rekombinant olarak üretilmesi ve antimikrobiyal etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Luffin P1, Luffa cylindrica bitkisinden izole edilen genin, C. glutamicum'daki heterolog üretimi için kodon optimizasyonu ile sentezlenmiştir. Moleküler biyoloji ve genetik teknikleri kullanılarak yapılan klonlama işleminin ardından, üretim için CGXII besiyeri tercih edilmiştir. Hücre parçalanması için bead-homogenizasyon ve ultrasonikasyon yöntemleri kullanılmıştır. Bead-homogenizasyon ile protein konsantrasyonu 17.56 mg/ mL iken, ultrasonikasyonla toplam protein verimi 2.50 mg/ mL olarak ölçülmüştür. Antimikrobiyal etki testlerinde, Escherichia coli TOP10 ve Saccharomyces cerevisiae BY4742'ye karşı herhangi bir etki gözlemlenmemiştir. Ancak, Fusarium culmorum üzerinde yapılan testlerde Luffin P1 ekspresyonu yapan C. glutamicum WT hücrelerinden elde edilen protein ekstraktı, %18.6’lık bir inhibisyon göstermiştir. Elde edilen bu sonuçlar, Luffin P1'in özellikle mantar enfeksiyonlarına karşı potansiyel bir biyolojik ajan olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu çalışma, Luffin P1’in antimantar etkisini keşfetmiş ve literatürde anti-HIV etkileriyle bilinen bu peptidin, yeni bir biyoteknolojik uygulama alanı olarak değerlendirilebileceğini ortaya koymuştur.

Recombinant production of membrane active peptides Excessive and improper use of antibiotics has led to the rapid increase of multi-drug resistant microorganisms, which the World Health Organization considers a serious threat to public health. Microorganisms enhance their survival capabilities by developing resistance mechanisms against antibiotics. In this context, naturally occurring antimicrobial peptides (AMPs) are gaining attention due to their low potential for inducing resistance and their broad spectrum activity. AMPs can exert lethal effects on microorganisms even at low concentrations and prevent resistance development through rapid interaction. This study aimed to recombinantly produce the ribosome-inactivating antimicrobial peptide Luffin P1 in Corynebacterium glutamicum WT cells and investigate its antimicrobial effects. Luffin P1 was synthesized from a gene isolated from Luffa cylindrica, optimized for heterologous expression in C. glutamicum. After cloning using molecular biology and genetic techniques, the CGXII medium was selected for production. Bead-homogenization and ultrasonication methods were employed for cell disruption. Bead-homogenization yielded a protein concentration of 17.56 mg/ mL, while ultrasonication resulted in a total protein yield of 2.50 mg/ mL. In antimicrobial activity assays, no effect was observed against Escherichia coli TOP10 and Saccharomyces cerevisiae BY4742. However, in disc diffusion tests against Fusarium culmorum, the protein extract from C. glutamicum WT cells expressing Luffin P1 showed 18.6% inhibition. These results demonstrate the potential of Luffin P1 as a biological agent against fungal infections. This study has discovered the antifungal effects of Luffin P1 and highlights its potential as a new biotechnological application, expanding on its known anti HIV properties in the literature.