Publication: Süt serumu proteinlerinden elde edilen biyoaktif fraksiyonların lipozomlanması
Abstract
1. ÖZET Sütün bileşiminde tüm ana besin unsurlarının yanında metabolik olaylar için gerekli olan vitaminler, mineraller, enzimler ve proteinler bulunmaktadır. Peynir üretimi sırasında sütün esas proteini olan kazein çöktürülmekte ve geriye kalan sıvı kısım “peynir altı suyu” veya “süt serumu” adını almaktadır. Peynir altı suyundaki çözünür proteinler çeşitli işlemler ile saflaştırılarak protein içerikleri farklı olan ve gıda endüstrisinde değişik amaçlarla kullanılan ürünler elde edilmektedir. Son yıllarda, süt serumu proteinlerinin insan sağlığı üzerine birçok yararlı etkileri olduğu gösterilmiştir. Çalışmamızda, önce peynir altı suyu tozundaki süt serumu proteinlerini kromatografik yöntemle fraksiyonlara ayırmayı daha sonra da biyolojik aktivite gösteren fraksiyonları lipozomlayarak bir kozmetik formülde kullanmayı amaçladık. Ekstraksiyon, filtrasyon ve santrifüjleme gibi ön işlemlerden sonra Sephadex G-50 jel kromatografisinden yararlanılarak majör süt serumu proteinlerini içeren bir fraksiyon ile küçük molekül ağırlıklı peptidleri içeren ikinci bir fraksiyonu elde edildi. Daha sonra, elde edilen fraksiyonların antioksidan ve sitotoksik aktiviteleri incelendiğinde birinci fraksiyonun en yüksek antioksidan aktiviteye sahip olduğu belirlendi. Sitotoksik aktivite analizinde filtrat ve diğer fraksiyonlarda 1 mg/ ml dozunda % 20 civarında sitotoksik aktivite görülürken, tüm fraksiyonların 500 μg/ ml’nin altındaki dozlarda proliferatif aktiviteye sahip oldukları ve en yüksek proliferatif aktiviteyi ikinci fraksiyonun gösterdiği gözlendi. Çalışmamızın ana hedefi, elde edilen biyoaktif fraksiyonların lipozomlanarak kozmetik formüllerde kullanılması olduğundan, sonraki aşamalarda bu yönde deneyler yapıldı. Öncelikle, süt serumu proteinlerini içeren lipozomlar hazırlandı ve boyut analizi yapıldı. Daha sonra elde edilen lipozomların ışık mikroskopu, elektron mikroskopu ve atomik kuvvet mikroskopu görüntüleri değerlendirildi. Son olarak, süt serumu proteinlerini içeren lipozomlar ile bir kozmetik formül (Carbopol jel) elde edildi. Antioksidan aktivite, Jel kromatografisi, Lipozom, Sitotoksik aktivite, Süt serumu proteinleri. 2 2.
CHARACTERIZATION OF LIPOSOMES PREPARED FROM BIOACTIVE FRACTIONS OF MILK SERUM PROTEINS Milk contains all the basic nutrients as well as minerals, vitamins, enzymes and proteins requied for metabolic events. Casein which is the main protein of milk is precipitated in cheese manufacture. The remaining fluid is called whey or milk serum. Soluble proteins present in whey are purified by a number of methods and used in the nutritional industry. It has been shown that whey and its components have a number of health promoting effects. We aimed to isolate fractions containing whey proteins using sephadex G-50 gel chromatography and then prepared liposomes using these bioactive fractions to obtain a gel suitable for cosmetic preparations. After extraction, filtration and centrifugation the pre-treated whey was applied to Sephadex G-50 chromatography and two fractions were obtained. The first fraction contained major whey proteins, while the second fraction had small peptides. We have then determined the antioxidant and cytotoxic activities of these fractions. The first fraction had the highest antioxidant activity. In terms of cytotoxic activity, all fractions showed 20 % cytotoxic activity at a dose of 1 mg/ ml and had proliferative activity at doses below 500 μg/ ml. The highest proliferative activity was in the second fraction. Our main objective was to prepare liposomes from bioactive fractions and use them in cosmetic formulas. We prepared liposomes containing whey protein fractions and analyzed their sizes. Then, we have investigated the liposome structures under light microscope, electron microscope and atomic force microscope. Finally, we have prepared a cosmetic formula (Carbopol gel) from liposomes containing the whey fractions. Key Words: Antioxidant activity, Gel chromatography, Liposome, Cytotoxic activity, Whey proteins. II) ekkür ii II) III) Şekil ve Tablolar vi 1. Özet 1 2. Summary 2 3. Giriş ve Amaç 3 4. proteinleri 4 4.1.1. Süt ve Yapısı 4 4.1.2. Peynir Altı Suyu ve Süt Serumu Proteinleri 5 4.2. Lipozom ve Lipozom Eldesi 12 4.2.1. Lipozomların Yapısı 12 4.2.2. Lipozomların Sınıflandırılması 13 4.2.3. Lipozomların Hazırlanması 14 4.2.4. Lipozomların Kullanım Alanları 17 4.3. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar 18 4.3.1. Serbest Radikaller 18 4.3.2. Serbest Radikallerin Biyolojik Etkileri 22 4.3.3. Serbest Radikallerin Hastalıklarla İlişkisi 26 4.3.4. Antioksidanlar 27 4.3.5. Antioksidanların Tedavi Amaçlı Kullanımı 29 4.4. Derinin Yapısı ve Deri Yüzeyinden Emilim 30 4.4.1. Derinin Yapısı, Fizyolojik ve Anatomik özellikleri 30 4.4.2. Deri Yüzeyinden Emilim 33 iii 5. Gereç ve Yöntem 34 5.1. Gereçler 34 5.2. Yöntemler 36 5.2.1. Süt Serumu Proteinlerinin Kromatografik Yöntemle Fraksiyonlara Ayrılması 36 5.2.2. Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Protein Analizi 38 5.2.3. Lowry Yöntemi ile Protein Tayini 39 5.2.4. Antioksidan Aktivite Ölçümü 40 5.2.5. Sitotoksik Aktivite Ölçümü 41 5.2.6. Süt Serumu Proteinlerinin Lipozomlanması 42 5.2.7. Lipozomlarda Yapılan İncelemeler 43 5.2.8. Süt Serumu Proteinlerini İçeren Lipozomlar ile Carbopol Jel Eldesi 43 6. Bulgular 44 6.1. Sephadex G-50 Kolon Kromatografisi 44 6.2. Antioksidan Aktivite Ölçümü 46 6.3. Sitotoksik Aktivite Ölçümü 47 6.4. Lipozom Eldesi 48 6.5. Lipozomlarda Yapılan İncelemeler 49 7. Tartışma ve Sonuç 57 8. Kaynaklar 61 9. Ekler 66 10. Özgeçmiş 75
CHARACTERIZATION OF LIPOSOMES PREPARED FROM BIOACTIVE FRACTIONS OF MILK SERUM PROTEINS Milk contains all the basic nutrients as well as minerals, vitamins, enzymes and proteins requied for metabolic events. Casein which is the main protein of milk is precipitated in cheese manufacture. The remaining fluid is called whey or milk serum. Soluble proteins present in whey are purified by a number of methods and used in the nutritional industry. It has been shown that whey and its components have a number of health promoting effects. We aimed to isolate fractions containing whey proteins using sephadex G-50 gel chromatography and then prepared liposomes using these bioactive fractions to obtain a gel suitable for cosmetic preparations. After extraction, filtration and centrifugation the pre-treated whey was applied to Sephadex G-50 chromatography and two fractions were obtained. The first fraction contained major whey proteins, while the second fraction had small peptides. We have then determined the antioxidant and cytotoxic activities of these fractions. The first fraction had the highest antioxidant activity. In terms of cytotoxic activity, all fractions showed 20 % cytotoxic activity at a dose of 1 mg/ ml and had proliferative activity at doses below 500 μg/ ml. The highest proliferative activity was in the second fraction. Our main objective was to prepare liposomes from bioactive fractions and use them in cosmetic formulas. We prepared liposomes containing whey protein fractions and analyzed their sizes. Then, we have investigated the liposome structures under light microscope, electron microscope and atomic force microscope. Finally, we have prepared a cosmetic formula (Carbopol gel) from liposomes containing the whey fractions. Key Words: Antioxidant activity, Gel chromatography, Liposome, Cytotoxic activity, Whey proteins. II) ekkür ii II) III) Şekil ve Tablolar vi 1. Özet 1 2. Summary 2 3. Giriş ve Amaç 3 4. proteinleri 4 4.1.1. Süt ve Yapısı 4 4.1.2. Peynir Altı Suyu ve Süt Serumu Proteinleri 5 4.2. Lipozom ve Lipozom Eldesi 12 4.2.1. Lipozomların Yapısı 12 4.2.2. Lipozomların Sınıflandırılması 13 4.2.3. Lipozomların Hazırlanması 14 4.2.4. Lipozomların Kullanım Alanları 17 4.3. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar 18 4.3.1. Serbest Radikaller 18 4.3.2. Serbest Radikallerin Biyolojik Etkileri 22 4.3.3. Serbest Radikallerin Hastalıklarla İlişkisi 26 4.3.4. Antioksidanlar 27 4.3.5. Antioksidanların Tedavi Amaçlı Kullanımı 29 4.4. Derinin Yapısı ve Deri Yüzeyinden Emilim 30 4.4.1. Derinin Yapısı, Fizyolojik ve Anatomik özellikleri 30 4.4.2. Deri Yüzeyinden Emilim 33 iii 5. Gereç ve Yöntem 34 5.1. Gereçler 34 5.2. Yöntemler 36 5.2.1. Süt Serumu Proteinlerinin Kromatografik Yöntemle Fraksiyonlara Ayrılması 36 5.2.2. Poliakrilamid Jel Elektroforezi ile Protein Analizi 38 5.2.3. Lowry Yöntemi ile Protein Tayini 39 5.2.4. Antioksidan Aktivite Ölçümü 40 5.2.5. Sitotoksik Aktivite Ölçümü 41 5.2.6. Süt Serumu Proteinlerinin Lipozomlanması 42 5.2.7. Lipozomlarda Yapılan İncelemeler 43 5.2.8. Süt Serumu Proteinlerini İçeren Lipozomlar ile Carbopol Jel Eldesi 43 6. Bulgular 44 6.1. Sephadex G-50 Kolon Kromatografisi 44 6.2. Antioksidan Aktivite Ölçümü 46 6.3. Sitotoksik Aktivite Ölçümü 47 6.4. Lipozom Eldesi 48 6.5. Lipozomlarda Yapılan İncelemeler 49 7. Tartışma ve Sonuç 57 8. Kaynaklar 61 9. Ekler 66 10. Özgeçmiş 75