Homosisteinin insan göbek kordon ven endotel hücre kültüründe enos ve ddah gen ekspresyonları üzerine etkisi

Abstract

Amaç: Artmış plazma homosistein seviyeleri, miyokard enfarktüsü, felç ve periferik vasküler hastalıklarda bağımsız bir risk faktördür. Bu çalışmada, homosisteinin nitrik oksit (NO) sentezini, biyoyararlanımını ve yıkımını nasıl etkilediğini ortaya koymak amacı ile endotel hücre kültüründe endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) ve dimetilarjinin dimetilaminohidrolaz (DDAH) gen ekspresyonları ile NO düzeyleri araştırılmıştır. Yöntem: Çalışmada insan göbek kordon ven endotel hücre kültürü (HUVEC) yapılmış ve kültür hücreleri 10, 50, 100, 500 ve 1000 µM homosistein konsantrasyonları ile 24 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra bu hücrelerden (~1x106 hücre) total RNA izolasyonu yapılarak ters transkriptaz (RT) reaksiyonu ile komplementer DNA (cDNA) eldesi sağlanmıştır. Elde edilen cDNA örnekleri eNOS ve DDAH transkriptlerine özgü primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile çoğaltılmıştır. PZR ürünlerinin agaroz jel elektroforezi sonrasında dijital jel görüntüleme sistemi ile dansitometrik olarak ölçümleri yapılmıştır. Ayrıca hücre kültürü medyumlarından elektrokemilüminesans yöntemi ile NO analizleri yapılmıştır. Bulgular: Elde edilen veriler ışığında, homosisteinin endotel hücre kültüründe eNOS ve DDAH gen ekspresyonları üzerine istatistiksel anlamlılık yaratacak herhangi bir etkisinin olmadığı gösterilmiştir. Buna karşın homosisteinin NO düzeyine hafif bir baskılayıcı etkisi olduğu görülmüştür. Sonuç: Sonuç olarak, homosisteinin NO üzerine etkisinin eNOS ve DDAH gen ekspresyonları düzeyinde olmadığı bu nedenle özellikle sübstrat düzeyinde denetim mekanizmaları üzerine yoğunlaşılması gerektiği düşünülmektedir.

Aim: Elevated plasma homocysteine levels is an independent risk factor for myocardial infarction, stroke and peripheral vascular disease. Aim of this study is to investigate effects of homocysteine on nitric oxide (NO) synthesis, bioavailability and degradation by analysis gene expression levels of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and dimethylarginine dimethylaminohydrolase (DDAH) and also NO levels in endothelial cell line. Material and Methods: Human umbilical vein endothelial cell culture (HUVEC) is done and incubated with various homocysteine concentrations (10µM, 50µM, 100µM, 500µM, 1000µM). After that, total RNA extracted from these cells and converted to cDNA. These cDNA samples are amplified with PCR for eNOS and DDAH genes. Then the products are run in agarose gel electrophoresis and analysed for densitometric measurement by gel imaging system. In addition, NOx is analysed in cell culture mediums with electrochemiluminesans method. Results: All these studies show that homocysteine has no statistically significant effect on eNOS and DDAH gene expressions in endothelial cell culture. On the other hand, homocysteine has a minor suppressive effect on NOx levels. Conclusion: These data suggest that the effect of homocysteine on NO levels is not through gene expression levels of eNOS and DDAH but it is at substrate level.