Design, fabrication, and characterization of corneal patches for tissue engineering application

Abstract

Korneal keratit, korneal perforasyonu önlemek için acil geniş spektrumlu antimikrobiyal tedavi gerektiren, yıkıcı, görme kaybına sebep olan oküler hastalıktır. Epitel bariyerde ki bir yırtıktan kaynaklanan kornea ülserinin tedavisi, avasküler yapıya sahip kornea stromasından dolayı zordur. Bu sebeple hasarlı korneanın onarımı, rejenerasyon kapasitesinin düşük olması nedeniyle çok uzun zaman alır. Kornea da geri dönüşü olmayan ciddi hasarlara neden olan bu hastalıkta geleneksel ilaç tedavilerin yetersiz kaldığı ve bu sebeple ilaçların farklı kombinasyonlarını içeren yenilikçi tedavi stratejilerine ihtiyaç duyulduğu bildirilmektedir. Doku mühendisliği uygulamalarıyla üretilen yara kapatıcı özelliğe sahip yamalar, hastalıklı bölgeye lokal uygulanması ve daha az antimikrobiyal ilaç kullanılarak tedaviye olanak sağlaması sebebiyle son yıllarda rağbet gören bir yaklaşımdır. Elektrospining yöntemiyle üretilmiş nanofiber yamalar, özellikle artan yüzey alanı sayesinde yüksek ilaç yükleme kapasitesine sahip olması, hücre tutunmasına olanak sağlaması, iyi mekanik dayanımı gibi üstün özellikleri sayesinde ilgi çekicidir. Ek olarak hidrojel bazlı ilaç yüklü yamalar ise üç boyutlu yapısı ve yüksek şişme kapasitesi sayesinde yara kapanmasını hızlandırıcı etkiye sahiptir. Bu çalışma da ilk olarak inbititör ve antifungal ilacın katmanlı bir şekilde yüklendiği PVA/ GEL nanofiberleri elektrospining yöntemiyle üretilmiştir. Çalışmanın diğer yaklaşımda ise yine aynı mantık ve yöntemle üretilen antibiyotik ve antifungal ilaç yüklü nanofiberler, biyofilm baskılayıcı inhibitör yüklü GelMA hidrojeli ile birleştirilmiştir. Üretilen bu yamaların kimyasal, morfolojik, termal, mekanik, sitotoksik ve in vitro salım profilleri gibi özellikleri ayrıntılı bir şekilde incelenmiş ve sonuçlar değerlendirilmiştir. Ayrıca, antifungal, antibakteriyel ve biyofilm baskılayıcı etkileri detaylı bir şekilde incelenmiştir. Elektron mikroskobu ile morfolojik özellikleri incelenen fiberlerin tek dağılımlı ve boncuksuz yüzeye sahip olduğu ilaç yüklendikçe nanofiber kalınlığının arttığı gözlemlenmiştir. GelMA hidrojelinin ise düzgün porozlu yapıya sahip olduğu görülmektedir. Kimyasal yapıları incelenen yamaların ilaçlarla iyi entegre olduğu, piklerinden anlaşılmaktadır. Şişme ve degredasyon deneyleri hidrojel yamaların nanofiberlere göre hem çok hem daha hızlı şiştiğini ve daha kolay bozunduğunu kanıtlamıştır. In vitro slım profilleri incelendiğinde özellikle çarpraz bağlanmış nanofiber yamaların ilaçları GelMA hidrojel bazlı yamalara göre daha yavaş ve kontrollü saldığı görülmektedir. Yapılan tüm antimikrobiyal ve biyofilm baskılaycı testler, üretilen yamaların antibakteriyal, antifungal ve inhibitör etkiye sahip olduğunu göstermiştir. Üretilen yamaların toksik özellik göstermedeği, hücrelerin güzel bir yapışma ve büyüme sergilediği hücre canlılığı analizleriyle kanıtlanmıştır. Sonuç olarak bu tez çalışmasında, kornea ülserinin tedavisi için yenilikçi bir yaklaşım olarak ilaç yüklü katmanlı nanofiber yamalar ve ilaç yüklü katmanlı nanofiber/ hidrojel yamalar başarıyla üretilmiştir.

Corneal keratitis is a devastating ocular disease that requires immediate broad-spectrum antimicrobial therapy to prevent corneal perforation. Treatment of corneal ulcers caused by a rapture in the epithelial barrier is difficult because of the avascular corneal stroma. For this reason, the repair of the damaged cornea takes a very long time due to its low regeneration capacity. It has been reported that in this disease, which causes serious irreversible damage to the cornea, traditional drug treatments are insufficient, therefore innovative treatment strategies including different combinations of drugs are needed. Patches with wound closure properties produced by tissue engineering applications are an approach that has been in demand in recent years, as they are applied locally to diseased areas and allow treatment using fewer antimicrobial drugs. Nanofiber patches produced by the electrospinning method are particularly interesting due to their superior properties such as high drug loading capacity thanks to the increased surface area, allowing cell adhesion, and good mechanical strength. In addition, hydrogel-based drug-loaded patches have an accelerating effect on wound closure thanks to their three-dimensional structure and high swelling capacity. In this study, firstly, PVA/ GEL nanofibers loaded with inhibitor and antifungal drugs in a layered manner were produced by the electrospinning method. In the other approach of the study, antibiotic and antifungal drug-loaded nanofibers produced with the same logic and method were combined with GelMA hydrogel loaded with a biofilm suppressor inhibitor. The chemical, morphological, thermal, mechanical, cytotoxic, and in vitro release profiles of these patches were examined in detail and the results were evaluated. In addition, its antifungal, antibacterial, and biofilm suppressive effects were studied in detail. It was observed that the nanofiber thickness increased as the drug was loaded, which had a monodisperse and bead-free surface of the nanofibers, whose morphological properties were examined by electron microscopy. It is seen that the GelMA hydrogel has a uniform porous structure. It is understood from the peaks that the patches whose chemical structures were examined were well integrated with the drugs. Swelling and degradation experiments have proven that hydrogel patches swell much faster and degrade more easily than nanofibers. When in vitro release profiles are examined, it is seen that especially cross-linked nanofiber patches release drugs slower and more controlled than GelMA hydrogel-based patches. All antimicrobial and biofilm suppressive tests have shown that the patches have antibacterial, antifungal, and inhibitory effects. It has been proven by cell viability analyzes that the patches produced are not toxic and that the cells exhibit good adhesion and growth. As a result, in this thesis, drug-loaded layered nanofiber patches and drug-loaded layered nanofiber/ hydrogel patches were successfully produced as an innovative approach for the treatment of corneal ulcers.