Sinkrotron X-ışınları yöntemlerinin biyolojik makromolekül yapısı çözümlenmesinde kullanılması

Abstract

Bu çalışmada sinkrotron X-ışın küçük açı saçılması (XSAS) ile çözeltideki proteinlerin yapısal özelliklerinin araştırılması amaçlandı. Deneyler için hücre sinyal ileti sisteminde temel rol oynayan heterotrimerik G-proteinlerinin sinir sisteminde en yaygın bulunan tipi olan Go-proteininin a-altbiriminin (Goa) rekombinant olarak E.coli'den saflaştırılması denendi. Rekombinant Goa, E.coli BL21(DE3) hücrelerinde pT7/ Nde1/ Goa vektörü kullanılarak sentezlendi. Ekspresyon seviyesi Western blot ve GTPgS bağlama yöntemleriyle belirlendi ve IPTG'den bağımsız olduğu saptandı. Protein izolasyonu çalışmalarına indüklenmemiş geniş ölçekli kültürlerde, Lee ve ark. tarafından verilen yöntem izlenerek başlandı. Saflaştırmanın her aşamasında , protein OD ölçümleri ile saptandı ve Goa'nın varlığı SDS-PAGE ve Goa'ya özgü bir antikor kullanılarak (NEN-Dupont) Western blot analizleriyle saptandı. Bazı kesimler GTPgS bağlama testleriyle de denendi. Bu çalışmalarda değişik aşamalarda Lee ve ark.'na uygun sonuçlar alınmadığından ve görülen safsızlıklar nedeniyle bazı değişiklikler yapıldı. Örneğin yüksek molekül ağırlığındaki proteinleri uzaklaştırmak amacıyla Gel Filtrasyon kromatografisi eklendi ve Q-Sefaroz kolonu Mono Q ile değiştirildi. Bu değişimler Goa ile aynı molekül ağırlığına sahip ve E.coli glisin parçalama enzim sisteminin bir üyesi olan T-proteininin de Goa ile birlikte saflaşmasına yol açtı. Goa saflaştırma çalışmalarına paralel olarak X-ışınları küçük açı saçılma deneyleri için T-protein kullanıldı. Bu deneyler proteinin girasyon yarıçapının 2.58 nm olduğunu ve asimetrik bir yapıya sahip bulunduğunu gösterdi. T-proteini için elde edilen X-ışınları saçılma deseni G-protein a-altbiriminden beklenilen desen ile karşılaştırıldı. Analiz sonuçları bu proteinin yapısı ile GDP bağlı, aktif olmayan yapıdaki heterotrimerik bir kimerik G-proteininin a-altbiriminin yapısı arasında yüksek benzerlik olduğunu ortaya koydu. Goa proteininin saflaştırma yöntemini optimize etme ve T-protein şeklinin belirlenmesi çalışmaları sürmektedir. tructural Analysis Of Biological Macromolecules By Using Synchrotron X-Ray Scattering Method

Our aim in this study has been to determine structural properties of proteins using synchrotron X-ray small angle scattering (XSAS). Isolation of Goa which is the a subunit of Go (Goa) , a major type of heterotrimeric G-protein in the nervous system was attempted for the measurements. Recombinant Goa was expressed in E.coli BL21(DE3) cells transformed with pT7/ Nde1/ Goa plasmid. Expression levels were determined by Western blot analysis and GTPgS binding tests and it was established that the level of expression was not dependent on IPTG concentration. Protein isolation studies were initially carried out according to the method described by Lee et al. using large scale cultures which were not induced. At every step of purification, protein was detected by OD measurements and the presence of Goa was monitored by SDS-PAGE and Western blot analysis using commercial Goa antibody (NEN-Dupont). Some fractions were also assayed for GTPgS binding activity. Due to the inconsistencies with the results of Lee et al. and due to inhomogeneities of the final product, some modifications were introduced to this procedure. For example, to remove large molecular weight contaminants a gel filtration chromatography step was added and the Q-Sepharose column was replaced with Mono Q. These modifications resulted in co-purification of an E.coli protein of nearly the same molecular weight, the T-protein of glycine cleavage system. Parallel to Goa purification studies, T-protein was used for XSAS measurements. These measurements yield 2.58 nm for the radius of gyration of T-protein and indicate that the protein has an assymetric shape in solution. The scattering pattern of T-protein was compared with that expected from a G-protein a subunit. Analyses indicate a high similarity between T-protein structure and the structure of GDP-bound inactive form of a-subunit of a chimeric heterotrimeric G-protein. Studies to optimize the purification of Goa and determination of T-protein shape are in progress.