Investigation of aporphine alkaloids for their antimicrobial activities

Abstract

APORFİN ALKALOİTLERİN ANTİMİKROBİYAL AKTİVİTELERİNİN ARAŞTIRILMASIMevcut antibiyotiklere direnç gösteren bakteri sayısındaki artışla birlikte farklı etki mekanizmalarına sahip yeni antimikrobiyallerin keşfine ihtiyaç duyulmuştur. Bu bağlamda bitkilerden elde edilen maddeler antimikrobiyal aktiviteleri ve farklı hedeflere bağlanma özellikleri ile dikkat çekmektedirler. Bu çalışmada, benzer kimyasal yapılara sahip boldine, bulbocapnine ve (-)-roemerine aporfin alkaloitlerinin mikrobiyal canlılık, proteom ve transkriptom üstündeki etkileri araştırılmıştır. Bacillus subtilis 168 model organizma olarak seçilmiştir. Farklı konsantrasyonlardaki alkaloitlerin mikrobiyal canlılık üzerindeki etkileri büyüme eğrileri ile gözlemlenmiştir. Bacillus subtilis 168’in endospor oluşturan bir bakteri olduğu göz önünde bulundurularak alkaloit çalışma konsantrasyonu 75 µg·µL-1 olarak belirlenmiştir. Canlı hücre sayıları koloni oluşturan birim metodu ile ölçülmüştür. Alkaloitlerin hücre bütününe olan etkileri taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenmiştir. Proteom ve transkriptom düzeyinde etki mekanizmalarının değerlendirilmesi için bir saat boyunca alkaloitlere maruz bırakılan hücreler kullanılmıştır. Ekspresyon seviyeleri farklı olan proteinler iki boyutlu jel elektroforezini takiben kütle spektroskopisi ile tanımlanmıştır. Transkriptom düzeyindeki değişiklikleri belirlemek için RNA sekanslama teknolojisi kullanılmıştır. Ekspresyon seviyesi değişen genler SubtiWiki veritabanındaki kategorilere göre sınıflandırılmıştır. RNA sekanslama sonuçları qPCR ile doğrulanmıştır. Seçilen alkaloitler arasında sadece roemerine hücre ölümüne neden olmuştur. Boldine ve bulbocapnine hücre yüzeyinde bazı değişiklikler yaratmalarına rağmen roemerine kadar etkili olmamıştır. Proteom ve transkriptom sonuçları değerlendirildiğinde, sadece roemerine antimikrobiyal aktivite göstermiştir. Roemerine’in hücre içerisinde birikmesi demir alımı gibi çeşitli yolakların tekrar düzenlenmesiyle sonuçlanan oksidatif strese ve reaktif oksijen türlerinin oluşmasına neden olmuştur.

INVESTIGATION OF APORPHINE ALKALOIDS FOR THEIR ANTIMICROBIAL ACTIVITIESIncrease in the number of resistant bacteria against existent antibiotics has necessitated the discovery of new antimicrobials with novel action mechanisms. In this respect, plant-derived substances are in focus due to their distinct antimicrobial activities and multi-target properties. In this study, effects of three structurally similar aporphine alkaloids, boldine, bulbocapnine, and (-)-roemerine, on microbial viability, proteome, and transcriptome were investigated. Bacillus subtilis 168 was selected as the model organism. Alkaloid effect on the microbial viability was followed by monitoring growth with different alkaloid concentrations. Alkaloid working concentration was set to 75 µg·µL-1 since higher concentration triggered endospore formation. Viable cell numbers were determined by measuring colony forming units. Effects of the alkaloids on whole-cells were visualized using a scanning electron microscope. Alkaloid effects on the proteome and transcriptome were investigated on one-hour alkaloid treated cells. Differentially expressed proteins were identified using two-dimensional gel electrophoresis followed by mass spectrometry. RNA-Sequencing technology was applied to get the changes at the transcriptomic level. Differentially expressed genes were classified according to the categories of SubtiWiki database. RNA-Sequencing results were validated by qPCR. Results have shown that among the selected alkaloids only roemerine ceased growth and caused bacterial death. Although boldine and bulbocapnine had some effects on cell surfaces, they were not as effective as roemerine. When proteome and transcriptome results were evaluated together, only roemerine showed antimicrobial activity. Roemerine accumulation resulted in oxidative stress and building up of reactive oxygen species, which eventually deregulated various pathways such as iron uptake.