Normal ve anormal koşullarda G protein ekspresyonunun düzenlenmesi

Abstract

Bu çalışmada hücre sinyal iletim sisteminde önemli yere sahip olan G-proteinlerinin a-altbirimlerindeki olası mutasyonların endokrin sisteminin hipofiz tümörlerinde oynadığı rol ve bu mutasyonların hastalık mekanizmasındeki potansiyel önemi araştırıldı. Gs ve Gi proteinlerinin a-altbirimlerindeki olası bazı mutasyonları incelemek için dokulardan DNA elde edildi. DNA elde edildikten sonra Gsa'nın 201 ve 227 numaralı kodonları ile Gi2a'nın 179 ve 205 numaralı kodonlarını içeren bölgeler özgün primerler kullanılarak PZR yöntemiyle çoğaltıldı. PZR ürünleri agaroz gellerinde yürütüldü ve EtBr ile boyanarak UV altında görüntülendi. PZR ürünlerindeki mutasyonlar, SSCP (Tek Sarmal Konformasyon Polimorfizmi) yöntemi kullanılarak incelendi. Örnekler gliserollü veya gliserolsüz olarak, 0.5XMDE (Mutasyon Belirleme), ve % 6 denatüre edici olmayan poliakrilamit jellerinde elektroforeze tabi tutuldu ve gümüş nitratla boyandı. Ayrıca nokta-emdirme düzeneği kullanılarak naylon filtreye emdirilen PZR ürünleri radyoaktif itaretlenmiş allel seçici problarla hibritleştirildi. SSCP yöntemi ile 5 hasta örneğinde 201 kodonunda 1 hasta örneğinde 227 kodonunda gsp mutasyonu düşünüldü. Ayrıca 179 ve 205 numaralı kodonlar için 3 hasta örneğinde gip mutasyonunu düşündüren farklar gözlendi. Gsa'nın 201 ve 227 Gi2a'nın ise 179 ve 205 kodonlarına özgün kontrol problarla (R 201, Q227, R179 ve Q205) etkileştirilen örneklerin tümünde, beklendiği gibi, pozitif sinyal alındı. Denenmiş değişik mutant problarla ise etkileşim sonucunda 4 hasta örneğinde 201 (arjinin yerine sistein) mutasyonu saptandı. Gi2á'nın 179 ve 205 kodonları için denenmiş problarla gip mutasyonuna rastlanmadı. R201C mutasyonları ile birtane R179P mutasyonu Kings College School of Medicine laboratuvarında yapılan dizi analiziyle doğrulandı.

The overexpression of G-protein a-subunits as a result of mutations has been assosiated with growth and neoplasia.Furthermore, G- proteins are thought to play a role in tumor invasion and metastasis. In this study, the presence of gsp and gip mutations in 22 pituitary adenoma tissue was investigated. DNA was isolated from tissue and the region encompassing codons 201 and 227 of Gsa and codon 179 and 205 of Gi2a were amplified using polymerase chain reaction. To identify the presence of gsp and gip mutations in pituitary adenomas, DNA samples were denatured and subjected to SSCP analysis in non-denaturing polyacrylamide gels and MDE gels with or without 6% glycerol. Comparison of the mobility of the variously folded single-strand conformers of tumor and normal DNA revealed differences in five samples for exon 8, in one sample for exon 9 and three samples for exon 5-6. The same DNA samples were dot blotted onto nylon membranes and hybridized with radiolabeled allele specific oligonucleotide probes. As expected, positive signals were obtained with the wild-type (R 201, Q227, R179 and Q205) probes in all tissue samples. However, only 4 samples hybridized with the mutant (R 201 C) probe.