Investigation of the effects of imidacloprid on different life stages of zebrafish (Danio Rerio) by proteomic approach

Abstract

İMİDAKLOPRİD’İN ZEBRA BALIĞI (Danio rerio) FARKLI YAŞAM EVRELERİ ÜZERİNE ETKİLERİNİN PROTEOMİK YAKLAŞIM İLE ARAŞTIRILMASI Pestisitler, günümüzde tarım zararlılarına karşı sıklıkla kullanılan kimyasallardır ve çevreye akış ve sızıntı yoluyla girerek hedef olmayan organizmalar üzerine toksik etkiler gösterirler. İmidakloprid, insektisitlerin merkezi sinir sistemini bloke etmeyi hedefleyen sentetik bir pestisittir ve su ortamında dakikalardan haftalara kadar değişen kararsız bir yarılanma ömrüne sahiptir. Bu tezin amacı, imidakloprid’in zebra balığı karaciğer ve beyin dokuları ile erken yaşam evreleri (embriyo ve larva) üzerindeki olası toksik etkilerinin, proteomiks, moleküler ve biyokimyasal analizler uygulanarak değerlendirmektir. Bu çalışmada, 6 saatlik embriyo, 72 saatlik larva ve ergin zebra balığı karaciğer ve beyin dokuları 48 saat 60 mg/ L imidakloprid’e maruz bırakılmıştır. Proteomik analizler nLC-MS/ MS metoduyla, cat, ache, gpx ve pxr gibi seçilmiş genlerin moleküler analizleri qPCR yöntemiyle, CAT ve AChE enzimleri ve GSH/ MDA seviyelerinin biyokimyasal analizleri ise spektrofotometrik yöntem kullanılarak değerlendirildi. Yapılan biyoinformatik analizler, karaciğer/ beyin dokuları ile embriyo ve larva grupları arasında ekspresyonu değişmiş proteinler açısından belirgin bir değişimin olduğunu ortaya çıkarmıştır. Karaciğer ve larva gruplarında protein ekspresyonunun arttığı, beyin ve embriyo gruplarına ait protein ekspresyonlarının ise azaldığı belirlenmiştir. Fonksiyonel protein analiz sonuçları, antioksidan ve bağışıklık tepkileri ile ilgili proteinler ve genlerin ifade düzeylerinde önemli değişiklikler olduğu görülmüştür. Apoptoz ve ER stresi ile ilişkili yolakların artış yönünde düzenlendiği gözlenirken, gelişim, translasyon ve metabolik yolakların ifadelerinin azaldığı görülmüştür. Embriyo grubu dışındaki deney gruplarının gen ekspresyon seviyeleri azalma göstermiştir. Buna karsın, elde edilen biyokimyasal verilerde CAT ve AChE enzim aktiviteleri ve GSH seviyelerinin yükseldiği gözlenmiştir. MDA seviyeleri ise tüm gruplarda azalmıştır. Çalışmamızda, proteomiks, moleküler ve biyokimyasal yöntemler kullanılarak imidacloprid’in antioksidan ve gelişim mekanizmalarının düzenlenmesi, ksenobiyotik yanıtın oluşturulması, gelişim ve nörokoruyucu genlerin ve antioksidan enzimlerin aktivasyonu gibi yolaklar üzerine olası zararlı etkilerinin sonuçları incelendiğinde, bu farklı üç yöntemin birbirlerini destekler nitelikte olduğu görülmüştür. Bu çalışmada, proteomik analizlerden elde edilen veriler, moleküler yöntemlerle belirlenen bazı stres belirteci gen ekspresyonlarının bulguları ve biyokimyasal parametrelerin sonuçları bize imidacloprid’in zebra baliği erken yasam evreleri (embriyo ve larva) ve ergin zebra baliği dokuları üzerine olumsuz etiklerinin olduğunu kanıtlamıştır.

INVESTIGATION OF THE EFFECTS OF IMIDACLOPRID ON DIFFERENT LIFE STAGES OF ZEBRAFISH (Danio rerio) BY PROTEOMIC APPROACH Pesticides entering the environment through runoff and leaching raise concerns about their effects on non-target organisms. Imidacloprid (IMI) is a synthetic pesticide that targets central neural system of the insects with an unstable half-life in water, ranging from minutes to weeks. The aim of this thesis was to investigate the effects of IMI on zebrafish liver and brain tissues, as well as their early life stages, utilizing proteomic, molecular, and biochemical analyses. Adult zebrafish, as well as embryos and larvae at 6 and 72 hpf, were exposed to a concentration of 60 mg/ L IMI for 48 h. The evaluation involved analyzing the proteome through nLC-MS/ MS, assessing selected genes such as cat, ache, gpx, and pxr through qPCR, and measuring selected biochemical biomarkers including CAT and AChE enzyme activity, as well as GSH and MDA content using a spectrophotometer. The bioinformatics analysis of the proteomic assays revealed distinct patterns of differentiated proteins among the liver and brain tissues, embryos, and larvae groups. It was observed that the differentially expressed proteins in the liver and larvae subgroups were predominantly upregulated, whereas those in the brain and embryo subgroups were predominantly downregulated. The functional enrichment analysis highlighted the regulation of antioxidant and immune responses, along with notable alterations in gene expression levels. The upregulation was observed in pathways associated with apoptosis and ER stress, while downregulation was linked to development, translation, and metabolic pathways. Gene expression profiles, except for the embryo group, demonstrated a tendency towards downregulation. However, the biochemical results varied among the groups, with elevated CAT and AChE activities and GSH observed in majority of the groups, decreased MDA. The gene expression and biochemical findings reflect the stress responses of the zebrafish liver and brain tissues, as well as the embryos and larvae. Proteomes’ bioinformatics analysis outcomes with selected genes and biochemical stress biomarker assays, outcomes highlighted the adverse effects of IMI, including the regulation of antioxidant mechanisms and development, xenobiotic response, and the activation of neuro-protective genes and enzymes on zebrafish liver and brain tissues, and embryo and larvae.