Evaluation of thymol and carvacrol as efflux pumps inhibitors in staphylococcus aureus

Abstract

Çoklu ilaç dirençli bakterilerin sayısındaki artış yeni antimikrobiyal stratejileringeliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Staphylococcus aureus bu tehlikeli patojenlerdenbiridir. Pek çok enfeksiyon hastalığına neden olmasının yanında antibiyotiklere maruziyetgibi değişen çevre koşullarına hızla direnç geliştirebilmektedir. Son zamanlarda çok hedeflidoğal ürünler hastalık kaynağı bakterilere karşı etkili antibakteriyel ajanlar olarakdüşünülmektedir. Bu amaçla bu çalışmada berberin, timol ve karvakrolün S.aureus’takisinerjik etkileri araştırılmıştır. Bu etkileşim checkerboard mikrodilüsyon metodukullanılarak belirlenmiştir. Sonuç olarak timol ve karvakrolün aynı antimikrobiyal etkiyesahip olduğu bulunmuş, bu nedenle daha sonraki çalışmalar sadece berberin ve timolünsinerjik olduğu 32 μg/ mL berberin & 64 μg/ mL timol kombinasyonu kullanılarakgerçekleştirilmiştir. Bu kombinasyonun S.aureus büyüme profili üzerindeki etkisi büyümeeğrisi analizi ile gözlenmiş, canlı hücre sayımı koloni oluşturan birimlerin hesaplanması ilegerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak berberin ve timolle maruziyetin hücre büyümesini inhibeederek bakteriyel ölüme neden olduğu görülmüştür. Kullanılan doğal ürünlerin hücreselbütünlüğe olan etkisi taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenmiş, sonuçta hücrelerdemorfolojik değişimlere neden oldukları görülmüştür. Diğer yandan timol & berberinkombinasyonunun biyofilm oluşumunu baskılama ve var olan biyofilmi yok edebilmepotansiyelleri incelenmiştir. İki doğal ürün biyofilm oluşumunu engellemede de sinerjiketkileşim göstermişlerdir, ancak biyofilmi ortadan kaldıracak etkiye sahip olmadıklarıbulunmuştur. Son olarak kullanılan doğan ürünlerin transkriptom düzeyinde etkisinibelirlemek için RNA sekanslama teknolojisi kullanılmıştır. Ekspresyon seviyesindedeğişiklik olan genler belirlenerek AureoWiki veritabanına göre gruplandırılmıştır.Transkriptom analizine göre taşıma ve bağlanma mekanizmaları, membran ve hücreduvarının yeniden organizasyonu, ATP ve protein sentezi, virulans ve patojenite gibi çeşitlimetabolizmalara ait genlerin düzenlenmesinde rol aldıkları bulunmuştur.

Increase in the number of multidrug-resistant bacteria necessitates the development of newantimicrobial strategies. Staphylococcus aureus is one of these dangerous pathogens. Itcauses many infectious diseases and is capable of developing rapid resistance to changingenvironmental conditions such as antibiotic treatment. Lately, multiple-targeted naturalproducts are being considered as effective antibacterial agents against disease-makingbacteria. For this purpose, in this study synergistic activities of berberine, thymol andcarvacrol were assessed in S.aureus. Checkerboard microdilution method was used toidentified interaction of berberine with both thymol and carvacrol. As a result, bothcombinations were found to have same antimicrobial activity. Therefore, later experimentswere performed only with thymol and berberine, and working concentrations were set to 32μg/ mL berberine and 64 μg/ mL thymol which were determined as synergistic. Effects ofthe compounds on the growth profile of S.aureus were observed by growth curve analysis,and the number of viable cells was calculated by measuring colony forming units. Resultshave shown that exposure to berberine and thymol inhibited cell growth and causedbacterial death. Then, using scanning electron microscopy, effects of berberine and thymolon whole-cells were visualized. Morphological changes were observed on the structure ofberberine and thymol treated cells. The ability of the components to prevent biofilmformation and eradicate preformed biofilms was also examined. They were found to besynergistic on suppression of biofilm formation, although they could not eliminate formedbiofilms. RNA sequencing technology was used to investigate the effects of naturalproducts on S.aureus transcriptome. Differentially expressed genes were identified andclassified according to AureoWiki database. Based on transcriptome analysis, they werefound effective on the regulation of the genes belong to various metabolisms such astransport and binding mechanism, reorganization of membrane and cell wall, ATP andprotein synthesis, virulence and pathogenicity.