Ayvalık Tuzlası’nda izole edilen halofilik bakterilerin karaterizasyonu

Abstract

Ayvalık Tuzlası Türkiye'de tuz üretiminin gerçekleştiği önemli deniz tuzlalarından biridir. Çalışmamızda bu bölgeden alınan tuzlu su ve tuzların kimyasal analizleri sonucunda tuzlu sudaki toplam sertlik 5.25 F., Na+ 49 g/ l, Cl- 5600 g/ l, Ca++ 18 g/ l, Mg++ 1.82 g/ l, HCO3- 167.14 g/ l, SO4-2 12.3 g/ l ve pH 8.87 olarak; tuz örneğinde ise toplam sertlik 3085 F., Na+ 343 g/ l, Cl- 973000 g/ l, Ca+2 2120 g/ l, Mg+2 6208.65 g/ l, HCO3- 240.34 g/ l, SO4-2 4.98 g/ l ve pH 8.49 olarak belirlenmiştir. Tuz örneğindeki uçucu madde (nem) miktarı ise % 0.83 olarak tespit edilmiştir. Ayvalık Tuzlası'ndan izole edilen aşırı halofilik bakterilerin tümünün Gram negatif, hareketli, 2.5-5.0 m boyutunda düzensiz çomak, üçgen, kare halinde hücreler olduğu saptanmıştır. Ayrıca bu bakteriler pastel pembe, koyu kiremit kırmızısı, kan kırmızısı, pembe, yavru ağzı, kırmızı ve krem renkli; yuvarlak, düz kenarlı koloniler oluşturmuşlardır. olduğu saptanmıştır. Tuzlardan ayrımı yapılan bakteri suşlarının C50 karotenoidlerinden dolayı renkli pigmentler içerdikleri düşünülmektedir. Biyokimyasal ve enzimatik test sonuçlarına göre aşırı halofilik bakterilerin tamamı pozitif oksidaz ve katalaz aktivitesi göstermiştir. Arjinin varlığında anaerobik büyüme ve triptofandan indol üretimine ise negatif reaksiyon gösterdikleri gözlenmiştir. Ayrıca aşırı halofilik bakterilerin tümünde kazein, Tween 20 ve Tween 80 hidrolizlerinin negatif olduğu belirlenmiştir. Nitrat varlığında aerobik ve anaerobik koşullar altında gelişmişlerdir. Suşların % 86'sı aerobik, %71.4'ü ise anaerobik koşullarda nitratı nitrite indirgeyebilmişlerdir. Ayrıca nitratı nitrite indirgeyen bakterilerin tümünün anaerobik ortamda gaz oluşturabildiği saptanmıştır. Aşırı halofilik bakterilerin % 86'sı nişastayı, % 57'si ise jelatini hidroliz edebilmiştir. Bu suşların farklı antibiyotiklere karşı olan duyarlılıkları disk difüzyon metodu ile belirlenmiştir. Bu suşların basitrasin (10U), novobiosin (5 g) ve eritromisin'e (15 g) karşı duyarlı; ampisilin (10 g), kloramfenikol (30 g), penisilin G (10U), gentamisin (10 g), sefadroksil (30 g), trimethoprim/ sulfamethozol (1.25 g/ 23.75 g), tetrasiklin (30 g), siprofloaksasin (5 g), amikasin (30 g), spiramisin (100 g) ve streptomisin'e (10 g) karşı ise dirençli olduğu saptanmıştır. Lowry Metodu protein konsantrasyonunun tespitinde uygulanmıştır. Aşırı halofilik bakterilerden izole edilen protein, kuyu başına 25 g gelecek şekilde tatbik edilip sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezinde uygulanmıştır. Elektroforez işlemi sonunda 2 ve 7 numaralı suşlar ile; 3, 5 ve 8 numaralı suşların protein profillerinin birbirlerinin aynısı olduğu ve aynı cins altında bulunabileceği gözlenmiştir. Diğer 1, 4, 6, 7, 9 ve 10 ile belirlenen suşların ise protein paternlerinin farklı oldukları saptanmıştır. Ayvalık Tuzlası'ndan izole edilmiş olan suşlardan 1, 2, 3 ve 4 numaralı olanlar fosfatidil gliserol (PG), fosfatidil gliserofosfatın metil esteri (PGP-Me), fosfatidil gliserosülfat (PGS) fosfolipidleri ve triglikosil dieter (TGD-2) glikolipidlerine; 5, 6 ve 7 ile numaralandırılan polar lipidler ise fosfatidil gliserol (PG), fosfatidil gliserofosfatın metil esteri (PGP-Me), fosfatidil gliserosülfat (PGS) fosfolipidleri ve sülfatlanmış diglikosil dieter (s-DGD-1) glikolipidinin C20C20 türevlerine sahiptir. İnce tabaka kromatografisi sonucu elde etmiş olduğumuz bu polar lipid sonuçlarına göre Ayvalık Tuzlası'ndan ayrımı yapılan 1, 2, 3 ve 4 numaralı suşlarımızın Haloarcula cinsine; 5, 6 ve 7 ile numaralandırılmış suşların ise Halorubrum cinsine ait türler olabileceği tespit edilmiştir. Plazmid izolasyonu çalışmamızda agaroz jel elektroforezinde 11 farklı kilobaz çifti bulunan standart plazmid markerlerine dayanılarak, Ayvalık Tuzlası'ndan izole edilen örneklerin de plazmid boyutları saptanmıştır. 4 ve 6 numaralı suşlarda 157.5 kilobaz çifti ve 7 numaralı suşta 153 kilobaz çiftine sahip birer plazmid bandı gözlenmiştir. 5 numaralı suşta ise 138 ve 103 kilobaz çiftine sahip iki plazmid bandı bulunmaktadır. Elde ettiğimiz test sonuçlarına göre Ayvalık Tuzlası'ndan izole edilen aşırı halofilik bakterilerin Halobacteriaceae familyasına; Haloarcula ve Halorubrum cinsine ait Arkeabakteri olabilecekleri anlaşılmıştır. Ayvalık Saltern is one of the most important salterns in Turkey. Chemical analysis of brine and salt samples obtained from Ayvalık showed that the average of total hardness, Na+ , Cl-, Ca++, Mg++, HCO3-, SO4-2 and pH of the brine was 5.25 F., 49 g/ l, 5600 g/ l, 18 g/ l, 1.82 g/ l, 167.14 g/ l, 12.3 g/ l and 8.87, respectively. The total hardness, Na+ , Cl-, Ca++, Mg++, HCO3-, SO4-2 and pH of the salt samples were 3085 F., 343 g/ l, 973000 g/ l, 2120 g/ l, 6208.65 g/ l, 240.34 g/ l, 4.98 g/ l and 8.49, respectively. The amount of water content was calculated as 0.83 % in the salt sample. All of the extremely halophilic bacteria which were isolated from Ayvalık Saltern were Gram-negative and motile. The cells were 2.5-5.0 m in length, pleomorphic rod, triangle and square shaped. All of the colony forms were circular and margin forms were entire. Colonies appeared pale pink, dark brick red, blood red, pink, pinkish orange, red and cream. In this study colonies of most strains were various shades of red due to the presence of C50 carotenoids. According to the results of biochemical and enzymatic tests all the extremely halophilic bacteria showed positive oxidase and catalase hydrolysis. However they showed negative growth in the presence of arginine in anaerobic conditions and negative reaction to indol production. All of the strains showed negative casein, Tween 20 and Tween 80 hydrolysis. In the presence of nitrate all isolates were grown in both aerobic and anaerobic conditions. 86 % of isolates in aerobic and 71.4 % in anaerobic conditions reduced nitrate to nitrite. Gas production was observed in the strains which reduced nitrate to nitrite in anaerobic conditions. 86 % of the extremely halophilic bacteria hydrolysed starch and 57 % of the strains hydrolysed gelatin. These strains were tested by disk diffusion method for their sensitivity to 14 different antibiotics. Most of these strains were found to be susceptible to bacitracin (10U), novobiocin (5 g) and erythromycin (15 g); but resistant to ampicilin (10 g), chloramphenicol (30 g), penicillin G (10U), gentamicin (10 g), cefadroxil (30 g), trimethoprime/ sulfamethoxazole (1.25 g/ 23.75 g), tetracycline (30 g), ciprofloxacin (5 g), amikacin (30 g), spiramycin (100 g) and streptomycine (10 g). Lowry Method was applied for the determination of protein concentration. 25 g of the isolated protein were applied to the sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After the electrophoresis, strains 2 and 7 formed similar protein profiles and could be classified under the same genus. Also, strains 3, 5 and 8 showed similar protein patterns. However, strains 1, 4, 6, 7, 9 and 10 had different protein profiles. All of the isolates had the main polar lipids of C20C20 derivatives. The first four strains isolated from Ayvalık Saltern harboured phosphatidyl glycerol (PG), phosphatidyl glycerol phosphate methyl ester (PGP-Me), phosphatidyl glycerol sulphate (PGS) and triglycosyl diether (TGD-2). The others had phosphatidyl glycerol (PG), phosphatidyl glycerol phosphate methyl ester (PGP-Me), phosphatidyl glycerol sulphate (PGS) phospholipids and sulfated diglycosyl diether (s-DGD-1) glycolipids. Thin layer chromatography results showed that the first four of seven strains belonged to Haloarcula genus and the others to Halorubrum genus. Plasmid isolation and determination of the plasmid sizes of the strains were done with the agarose gel electrophoresis. Strains 4 and 6 had a plasmid with a size of 157.5 kilobase pair and strain 7 had a plasmid band with 153 kilobase pair. Strain 5 had 2 plasmids of 138 and 103 kilobase pair in size. Regarding the obtained results the extremely halophilic bacteria isolated from Ayvalık Saltern are most probably the members of the Halobacteriaceae family and the genus of Haloarcula and Halorubrum. 07.2002 Rahel ELEVİ