Kitozan esaslı taşıyıcı sistemler ile deriden gen transferinin araştırılması

Abstract

KİTOZAN ESASLI TAŞIYICI SİSTEMLER İLE DERİDEN GEN TRANSFERİNİN ARAŞTIRILMASI Lokal ve sistemik ilaç uygulamaları için deri, vücudun en uygun organıdır. Bu çalışmada, kitozan-esaslı değişik farmasötik formlar, deriden DNA uygulaması için araştırılmıştır. Bu çalışmada DNA taşıyan 3 farmasötik şekil; kitozan hidrojel, nanopartikül, lipozom ve kitozan kaplı lipozom formülasyonları hazırlanmış, formülasyonların fiziko-kimyasal özellikleri, in vitro ve in vivo transfeksiyon etkinlikleri ayrıntılı olarak incelenmiştir. Her üç formun da DNA’yı kontrollü serbestleştirdiği, in vitro ve in vivo stabilitesini olumsuz yönde etkilemediği ve DNA’yı enzimatik etkilerden koruduğu saptanmıştır. Kontrolleri yapılan ve özellikleri belirlenen farmasötik şekiller, in vitro ve in vivo transfeksiyon çalışmalarında kullanılmıştır. İn vitro DNA transfeksiyon çalışmalarında, NIH 3T3 ve Swiss 3T3 fare fibroblast hücre kültürleri ve primer insan dermal fibroblast hücre kültürü kullanılmıştır. Formülasyonların, DNA transfeksiyon etkinlikleri, pSV-β-Gal plazmidi tarafından kodlanan β-galaktozidaz ekspresyonu ile saptanmıştır. İn vitro transfeksiyon çalışmalarında; en yüksek düzeyde transfeksiyon etkinliği ve gen ekspresyonu, lipozom formülasyonlarında gözlenmiştir. İn vitro transfeksiyon etkinliği açısından formülasyonların gen transferinde kullanılabilirliğinin, kitozan kaplı lipozom > lipozom > hidrojel > nanopartikül sıralamasına uygun sonuçlar verdiği belirlenmiştir. İn vivo DNA transfeksiyon çalışmalarında ise yavru ve genç erişkin Sprague-Dawley sıçanlar kullanılmıştır. Enzim testleri ve histolojik incelemeler sonucunda; gen ekspresyonunun, derinin dermis ve hipodermis tabakalarında 7 gün süresince devam ettiği saptanmıştır. İn vitro transfeksiyon çalışmalarından farklı olarak, in vivo transfeksiyon etkinliği açısından formülasyonların gen transferinde kullanılabilirliğinin, kitozan kaplı lipozom > lipozom > nanopartikül > hidrojel sıralamasına uygun sonuçlar verdiği belirlenmiştir. Sonuç olarak, kitozan-esaslı taşıyıcı sistemlerden olan kitozan hidrojel, kitozan nanopartikül ve lipozom ve kitozan kaplı lipozomlar ile etkin bir şekilde deriden gen transferi mümkündür. Elde edilen veriler, deriden gen transferi ve gen tedavisi çalışmaları için temel oluşturmaktadır. AN INVESTIGATION OF CHITOSAN-BASED CARRIERS FOR GENE TRANSFER THROUGH THE SKIN The skin is an attractive and the largest organ for local and systemic drug applications. In present study, chitosan-based pharmaceutical forms were investigated for nucleic acid delivery into the skin. In this study, three different pharmaceutical forms including chitosan hydrogels, nanoparticles, liposomes and chitosan-coated liposomes were prepared for gene delivery. Physico-chemical properties and in vitro / in vivo transfection characteristics of these formulations were investigated in detail. It was observed that all of three forms demonstrated controlled-release of DNA, had no negative effect on the stability of DNA and protected DNA from enzymatic degradation in in vitro and in vivo conditions. After the control and characterization of these forms, they were used for DNA transfection. Mouse fibroblastic NIH 3T3 and Swiss 3T3 cell lines and primary human dermal fibroblasts were used for in vitro DNA transfection experiments. Transfection efficiency of formulations was monitored by measuring of β-galactosidase activity expressed by β-Gal reporter plasmid. Among the pharmaceutical forms, the higher DNA-transfection efficiency and reporter gene expression was obtained with liposome formulations than that of other forms. From the point of DNA-transfection efficiency, the capability of different pharmaceutical forms were ordered as chitosan coated liposome > liposome > hydrogel > nanoparticle. Pups and young adult Sprague–Dawley rats were used for in vivo DNA-transfection studies. By using enzyme assays and histological techniques, it was shown that the reporter gene expression in dermis and hypodermis layers of skin sustained for 7 days. In contrast to in vitro results, for the in vivo counterpart the DNA-transfection efficiency of the forms were obtained as chitosan-coated liposome > liposome > nanoparticle > hydrogel. As a result, chitosan-based delivery systems including hydrogels, nanoparticles, chitosan coated liposomes and liposomes can be efficiently used for DNA transfer through the skin. These results will form the basis for gene delivery and gene therapy via the skin.