VEGF'e karşı üretilen monoklonal antikorların afinite kromatografisi ve alternatif olarak çoklu mod kromatografi yöntemleri kullanılarak saflaştırılması

Abstract

Amaç: Bu çalışmada, hücre kültürü ortamında vasküler endotelyal büyüme faktörü’ne (VEGF) karşı üretilen monoklonal antikorların (mAb) afinite kromatografisi ve alternatif olarak çoklu mod kromatografi yöntemleri kullanılarak saflaştırılması amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Anti-VEFG özelliği gösteren mAb hücre kültürü ile elde edildi. Hem afinite (Protein A) kromatografisi yöntemi ile hem de çoklu mod kromatografi yöntemi kullanılarak elde edilen mAb’lar saflaştırıldı. Ardından, Modde.13 Deneysel Tasarım (DoE) çalışmaları yardımıyla saflaştırma yöntemleri için optimum koşullar belirlendi. Bu optimum koşullar yardımı ile tekrar çalışmaları gerçekleştirildi. Uygulanan tüm saflaştırma çalışmaları sonucunda elde edilen ürünler HPLC yöntemleri yardımıyla analiz edilip asidik varyant - bazik varyant ve yüksek molekül ağırlıklı (HMWS) - düşük molekül ağırlıklı (LMWS) safsızlıklar açışından değerlendirildi. Gerçekleştirilen saflaştırma çalışmalarının % verim hesapları yapılarak her iki kromatografik yöntem açısından karşılaştırıldı. Saflaştırılan mAb’ların molekül ağırlıkları sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) yöntemi ile tespit edilerek doğrulandı. Bulgular: Hem çoklu mod kromatografi yöntemi hem de Protein A kromatografi yöntemi uygulanarak anti-VEGF özelliği gösteren mAb başarılı bir şekilde saflaştırıldı. Her iki saflaştırma yöntemi ile elde edilen mAb ürünlerinin HMWS-LMWS safsızlık analiz sonuçları birbirleri ile benzerdi. Ayrıca çoklu mod kromatografi ile elde edilen asidik varyant - bazik varyant sonuçları, Protein A kromatografisine kıyasla daha iyiydi. Yük varyantları çoklu mod kromatografi ile daha etkin olarak uzaklaştırıldı. Sonuç: Anti-VEGF özelliği gösteren mAb için, maliyeti daha düşük olan çoklu mod kromatografik saflaştırma yönteminin Protein A kromatografik saflaştırma yöntemine alternatif olabilir.

Objective: In this study, it was aimed to purify monoclonal antibodies (mAb) produced against vascular endothelial growth factor (VEGF) in cell culture medium by using affinity chromatography and alternatively multi-mode chromatography methods. Materials and Methods: mAb showing anti-VEFG properties was obtained by cell culture. The mAbs obtained were purified using both the affinity (Protein A) chromatography method and the multi-mode chromatography method. Then, optimum conditions for purification methods were determined with the help of Design of Experiments (DoE) studies with the Modde.13 program. Repeat studies were carried out with the help of these optimum conditions. The products obtained as a result of all purification studies were analyzed with the help of HPLC methods and evaluated in terms of acidic variant - basic variant and high molecular weight (HMWS) - low molecular weight (LMWS) impurities. The % yield of the purification studies was calculated and compared in terms of both chromatographic methods. The molecular weights of the purified mAbs were determined using the sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) method and their accuracy was proven. Results: By applying both the multi-mode chromatography method and the Protein A chromatography method, the mAb showing anti-VEGF properties was successfully purified. HMWS-LMWS impurity analysis results of mAb products obtained by both purification methods were similar to each other. Additionally, the acidic variant - basic variant results obtained with multi-mode chromatography were better then Protein A chromatography. The charge variants were removed more effectively by multimode chromatography. Conclusion: The multi-mode chromatographic purification method with lower expense could be an alternative to the Protein A chromatographic purification method for mAb showing anti-VEGF properties.